Cinsel Gelişim ve askopor Deşarj Fusarium graminearum</em

1. Perithecia Üreten F. verimli bir suşu ile 6.0 cm çaplı Petri kabındaki Merkezi inokülasyon havuç agar 10 graminearum'un (PH-1 Tavsiye). Yeri oda sıcaklığında (18-24 ° C) parlak floresan ışıkları altında yemekler aşılanmış ve misel Petri (3-5 gün) dış kenarına ulaşana kadar büyümeye olanak sağlar. Ticari ev floresan ışıkları meyve vücutta oluşumu ve akıntı teşvik için sorunsuz çalışır. Yavaşça steril bir kürdan ile havadan miselyumla kaldırın. Steril bir cam hockeystick veya steril bir cam çubuğun yuvarlak ucu ile yüzeye 1.0 ml% 2.5 Tween 60 aq dağıtın. Işığa plakalar dönün. Plakalara parafilm katmayın. 24 saat sonra, plaka yüzeyi parlak bir görünüme sahip olmalıdır. Eğer miselyumla belirirse, kazıma yüzey ve yeniden başvuru Tween-60 çözüm. Önümüzdeki hafta içinde perithecia gelişimi dikkate alınmalıdır. Bir ara aşamalarınperithecium geliştirme hafifçe RNA ekstraksiyonu (Şekil 1) dondurulmuş agar ve flaş yüzeyini kazıyarak hasat edilebilir. Olgun sporlar Gün 7 ile plaka kapağında birikecektir. Başlangıçta bu sadece bir mikroskop altında görülebilir, ancak çıplak gözle olacak şekilde günde 9, onlar yeterli yoğunluğu birikmiş olacaktır. 2. Askopor Deşarj Tahlili 6. günde Tween çözüm uygulandıktan sonra, bir odun kurdu olan agar 1 cm çap daire kesip. Alternatif olarak, bir bisturi aynı büyüklükte bir bölümü kaldırmak için kullanılabilir. Daire yarısında dilimlenmiş ve her yarım bardak mikroskop lamı üzerine yerleştirilebilir. Orient adet meyve gövdeleri içeren yüzey sürgünün yüzeyine dik olacak şekilde, ve sporların sürgünün uzunluğu aşağı ateşlenir. Işıklar altında gece bir nem odasında slayt yerleştirin. Sporlar üzerinde birikecektirslayt ve çıplak gözle ertesi sabah (Şekil 2) görülebilir. Biriken sporların su ile yıkanmış ve kapama istenirse belirtilebilir. Potansiyel askopor deşarj inhibitörleri testin montaj sırasında agar bloğunun arkasına ekleyerek test edilebilir. Deşarj azaltmak bazı inhibitörleri daha önceden iyon kanalı bu teknik 15 ile test edilmiştir. 3. Rekombinant Döl üretimi F. iki suşları ile havuç agar aşılayarak çapraz Initiate graminearum (bir Nit + ve bir NIT-), Petri tabağı zıt tarafları üzerinde inokulasyon noktaları yerleştirilmesi. Bir kez hif yüzey doldurdu, hava bölümünü kazıyarak ve yukarıda açıklandığı gibi Tween-60 çözümü uygulayın. Hif karşılamak Petri tarafında dikkat edilmesi gereken bir işareti kullanın. Işık kültürler dönün ve perithecia geliştirdik kadar inkübe ve cirrhi olmak varsilahı iki kültür arasındaki kesişme boyunca perithecia gelen oluşturur. Iki kültürün kesiştiği boyunca perithecia görüntülemek içine mikroskop altında getirmek. Bir böceğin iğne ucu ile, steril ve steril suya batırılmış, iğne ucuyla hafifçe Bu sınır boyunca bir cirrhus dokunun. Pin üzerindeki nem cirrhus pin ayrılmamak için izin vermelidir. Sporlar yıkayın bir Eppendorf tüp içinde 200 ul steril su içinde üzerinde cirrhus ile pin ucu durulayın. Alev pimi tekrar ıslatın ve başka bir cirrhus seçin. 10-15 cirrhi çekme, ve su ile ayrı bir tüp içinde, her yerleştirin. Kısaca vorteks tüpler cirrhi askıya içermesin. 9 cm Petri kabındaki MMTS orta 1 bir pipet ve yer ile spor süspansiyon 60 ul çıkarın. Steril bir hokey sopası ile yayıldı. Geriye kalan spor süspansiyonu bir hafta için 4 ° C'de saklandı ve gerekirse kaplandı edilebilir. Inkübasyon3-5 gün oda sıcaklığında (gerekli değil ışık) az te çok küçük koloniler (Şekil 3) ortaya çıkıncaya kadar. Koloniler arasında fenotipleri iki tür olacak. Nit-koloniler Nit + koloniler daha sparser hif olacaktır. Rekombinant perithecia gelen Cirrhi yaklaşık olarak eşit oranda her iki koloni fenotipleri gösterecektir. Üzerlerinde tek bir fenotip koloniler ile plakaları atılır. Bazen ikiden fazla fenotip diğer faktörlere bağlı olarak segregasyon neden olduğunu not edin. V8 veya depolama için havuç agar kolonileri taşıyın. Doğru fenotipi onaylamak için; Czapek Kullanıcı Dox Agar (nit suşlar Czapek Kullanıcı Dox üzerinde büyümek olmaz) ve Klorat (Nit + suşlar Klorat ile PDA üzerinde büyümek olmaz 0,5 M Potasyum Klorat) ile PDA Testi koloniler. İstenilen niteliklere için bu kolonilerin inceleyin. 4. Temsilcisi Sonuçlar Perithecia Üreten Amaç bir çim sahip olmaktırHerhangi bir misel veya belirgin sporlar olmadan perithecia. Kültür yüzey siyah kadife (Şekil 1) benzer bir görünümde olacaktır. 24 saat at Tween uygulandıktan sonra ağar yüzeyine hafif bir parlaklık sahip olmalıdır. Miseller yeniden takdirde, bord perithecium gelişimi indüklemek için yeteri kadar sıyrılmıştır edilmemiş olabilir. Askopor deşarj Her zaman yabani tip suşu sizin test agar birkaç blok sağlar. Bu ateş yoksa, sonra ya perithecia çok genç veya çok yaşlı. Onlar çok eski ise, o çok sayıda hif bir beyaz renk veren kültür yüzey üzerinde görünür. Bu durumda değilse, çok genç olabilir ve deney 24 saat içinde tekrar denenmelidir. Bazen, kültürler de deşarj yoktur ve deneyi tekrarladı gerekecektir. Eğer uygun ışık koşullarında test gerçekleştirmek emin olun. Rekombinant döl <p class="jove_content"> Rekombinant perithecia iki suş arasındaki kesişme boyunca perithecia çoğunluğu kadar yapmak gerekir. Genellikle bir çapraz den 10 cirrhi işlemek ve bunlardan en az bir rekombinant 4-6 olmalıdır. Çok nadiren, bir mutasyon çiftleşme bir gerginlik engeller. Ebeveynlerden biri Aberan büyüme fenotipi varsa, en fazla 2 fenotipleri MMTS üzerinde koloniler arasında mevcut olabilir. Şekil 1. Havuç agar perithecium gelişim aşamaları. Tween uygulamadan sonra Sol, 72 saat. Kırmızı pigment ve yüzeyde siyah taneleri gibi görünen çok genç perithecia unutmayın. Sağ, 144 saatte, olgun perithecia oluşturmuşlardır. Her iki kültürde de yüzeysel misel ve tama yakın olmadığına dikkat edin. Şekil 2. Deşarj testi. Turuncu havuç agar tapa odaklı böylece tha olduğunuzorla yüzeyinde olgun perithecia boşaltılan t sporların cam sürgünün yüzeyinde birikebilir. 15 saat birikimi zaman. Şekil 3. Nit + ve seçici MMTS ortamda nit-koloniler arasında büyüme farklar. Nit-koloniler (ok başları) daha küçüktür. Nit + koloniler (oklar) güçlü büyüme göstermektedir. Fotoğraf 7 gün sonra alınır.