Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em> Pseudomonas aeruginosa</em> In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

1. Voorbereiding van Kunstmatige Sputum Medium (ASM) Voeg 4 g DNA van vis sperma 250 ml steriel water langzaam over een periode van verschillende uren. De DNA duurt verscheidene uren volledig oplossen en onmiddellijk kan worden bij kamertemperatuur geroerd. Voeg 5 g mucine van varkens maag (type II) langzaam naar 250 ml steriel water tot de mucine volledig is opgelost. De oplossing kan een nacht te roeren bij 4 ° C. Los 0,25 g per essentiële en niet-essentiële L-aminozuur, met uitzondering van L-tyrosine en L-cysteïne, in 100 ml steriel water. Los 0,25 g L-cysteïne in 25 ml 0,5 M kaliumhydroxide (M r 56,11 g / mol) en 0,25 g L-tyrosine in 25 ml steriel water. Los 5,9 mg diethyleentriaminepenta-azijnzuur (DTPA), 5 g NaCl en 2,2 g KCl in 100 ml steriel water. Meng de DNA mucine, L-aminozuren, DTPA, NaCl en KCl in een fles van 1 liter. Voeg 5 ml eigeel emulsion en vullen tot ongeveer 850 ml met steriel water. Pas de pH tot 6,9 met 1 M Tris (pH 8,5; M r 121,14) toe en breng het volume op 1 liter met steriel water. Steriliseer de ASM door middel van filtratie met behulp van een Vacuubrand ME 2 membraan vacuümpomp en Millipore Steritop filter units met een porie en nek afmeting van 0,22 pm en 45 mm, respectievelijk. Elke Steritop filter unit kan onmiddellijk worden hergebruikt tot drie keer, maar de filters moeten twee keer worden gespoeld met steriel water voor hergebruik. Het filtratieproces is langzaam en kan worden uitgevoerd gedurende 2 dagen. Andere versies van ASM ontwikkeld die gebruik maken van de toevoeging van antibiotica in plaats van filtratie 11 echter, als gevolg van mogelijke interacties tussen geneesmiddelen, raden wij de methode voor deze specifieke toepassing. Ongefilterde en gefiltreerd ASM worden bewaard bij 4 ° C in het donker. Het gebruik van vers ASM wordt echter aanbevolen kan worden gehouden onder deze omstandigheden maximaal een maand. </li> 2. Bepaling van de Planktonische Wintereik Cell Minimum Metabolic remmende concentratie (PSMIC) Om de minimale metabole remmende concentratie (PSMIC) waarden voor 15 planktonically gegroeid P. vast te stellen aeruginosa isolaten, de microverdunningsplaten methode moet worden uitgevoerd, zoals beschreven in de richtlijnen van de British Society for Antimicrobial Chemotherapie BSAC 12. De keuze antibioticum, in dit geval tobramycine sulfaat wordt serieel verdund in Luria-Bertani (LB) medium in een 96-wells microtiterplaat met een breed scala van antibioticaconcentraties voorzien. Verdun 's nachts culturen van P. aeruginosa in LB een OD 600 0,05 (± 0,01) en voeg 100 ul volume aan de putjes van de 96-well microtiter plaat met 100 ul van de serieel verdunde antibioticum. In dit geval, de eindconcentraties van tobramycine sulfaat varieerde tussen 512 tot 0,5 ug / ml. Acht herhalingen van elke ANTIBiotic concentratie moet worden uitgevoerd. Putjes voor negatieve controle voor elk isolaat moeten worden opgezet, waarin geen antibioticum wordt toegevoegd. Ook moet acht putjes bestaan ​​LB gebruikt als blanco stroomafwaarts (sectie 2.6). Incubeer de 96-well microtiter platen 1-2 dagen bij 37 ° C zonder schudden onder aërobe en Microaërofiele (5% O2, 10% CO2 en 85% N2) omstandigheden. Microaërofiele voorwaarden wordt verkregen met behulp van CampyGen gas generatie verpakkingen in grote anaerobe pot. Na incubatie wordt bacteriële groei bepaald door de absorptie van de bacteriecultuur in elk putje met een golflengte van 600 nm met een Omega Fluostar microplaat lezer en de MARS Gegevensanalyse Software. Absorptie van antibiotica behandelde planktonische culturen (A antibiotica behandeld planktonische cellen) en absorptie van de negatieve controles (A negatieve controle) moet worden gecorrigeerd door af te trekkenion van de achtergrond extinctie van de putjes met LB alleen (A blanco). Het percentage remming van de levensvatbaarheid wordt vervolgens berekend als (gemiddeld een antibioticum behandeld planktonische cellen /: een negatieve controle) x 100%. De PSMIC 90 wordt gedefinieerd als de concentratie die antibioticum 90% remming van planktonische bacteriële groei. Om bacteriële leefbaarheid bepalen na behandeling met het antibioticum keuze 10 ul 0,02% (v / v) resazurin (opgelost in gedestilleerd water) toegevoegd aan elk putje en de platen geïncubeerd onder aerobe omstandigheden voor 1-2 uur bij 37 ° C onder schudden bij 150 rpm. Levensvatbare cellen vermindert de blauwe resazurin kleurstof aan de roze fluorescerende resorufin vorm. Na incubatie met resazurin, toezicht houden op de fluorescentie van elk putje met een golflengte van 540 nm en een emissie golflengte van 590 nm in een Fluostar Omega microplaat lezer. De gegevens worden geanalyseerd zoals beschreven islaag. 3. Bepaling van de Biofilm Wintereik Cell Minimaal Remmende Concentratie (BSMIC) Overnachting culturen van P. aeruginosa (in dit geval 15 isolaten van P. aeruginosa worden) worden verdund in LB met een OD van 0,05 600 (± 0,01) en verder verdund 1:100 in verse ASM (totaal volume 1,8 ml). De verdunde cultures (1,8 ml) worden toegevoegd aan elk putje van een 24-wells weefselkweekplaten behandeld plaat. Drie putjes ASM bestaan ​​voor gebruik als een blanco stroomafwaarts analyse (punt 3.9). Zet de 24-well platen met laboratorium parafilm en incubeer 3 dagen onder aërobe en Microaërofiele omstandigheden bij 37 ° C onder schudden bij 75 rpm. Microaërofiele voorwaarden dienen te worden verkregen met behulp van CampyGen gas generatie verpakkingen in grote anaerobe pot. Verdun het antibioticum keuze, in dit geval tobramycine sulfaat, een passende concentratiebereik voorzien in versASM. In dit geval eindconcentraties varieerde 512-1 ug / ml. Voeg elke concentratie van het antibioticum, in hoeveelheden van 200 pi, de geschikte putjes van platen met 24 putjes. Vier herhalingen van elke antibiotica concentratie moet worden uitgevoerd. Biofilms niet blootgesteld aan de antibiotische keuze werden gebruikt als negatieve controle. Zet de 24-well platen met laboratorium parafilm en incubeer onder aërobe en Microaërofiele voorwaarden voor een verdere 24 uur bij 37 ° C onder schudden bij 75 rpm. Na incubatie in de aanwezigheid van het antibioticum keuze, kan het bacteriële biofilms met 100 ul van 100 mg / ml cellulase (verdund in 0,05 M citraatbuffer [9,6 g / l Citrate.H 2 0 in water en pH 4,6 met NaOH] ) en incubeer de 24-well platen onder aërobe omstandigheden bij 37 ° C onder schudden bij 150 rpm gedurende 1 uur. Indien nodig, kunnen biofilms verder worden verstoord door het manueel pipetteren in dit stadium. Om de metabolische activiteiten te bepalenvan de bacteriecellen vrijkomt uit de verstoord biofilm, 100 ul 0.02% (v / v) resazurin (opgelost in gedestilleerd water) worden toegevoegd aan elk putje van de 24 putjes en geïncubeerd voor 1-2 uur bij 37 ° C onder schudden bij 150 rpm. Na incubatie met resazurin, het meten van de fluorescentie van elk putje met een golflengte van 540 nm en een emissie golflengte van 590 nm in een Fluostar Omega microplaat lezer en de MARS data analyse software. Fluorescentie van het antibioticum behandelde biofilms (F antibiotica behandelde biofilms) en fluorescentie van de negatieve controles (F negatieve controle) wordt gecorrigeerd door aftrekking van de achtergrond fluorescentie verkregen uit de putjes die ASM alleen (F blanco). Het percentage remming van de levensvatbaarheid wordt vervolgens berekend als (gemiddelde van F antibiotica behandeld biofilms / gemiddelde F negatieve controle) x 100%. De BSMIC 90 wordt gedefinieerd als de antibiotic concentratie die 90% remming van de metabole activiteit. 4. Representatieve resultaten ASM biofilmvorming kan in kleine (2 ml) en de toevoeging biofilms volledig gevormd binnen de 3 dagen (figuur 1A). Dit kan worden aangetoond door streng pipetteren de biofilm, dat moet moeilijk te verstoren. De microkolonies zijn vergelijkbaar met die gekweekt in grotere hoeveelheden 4 (figuur 1b). Figuur 2 grote verschillen tussen cellen planktonically en in een biofilm gekweekt zoals gedetecteerd door elektronenmicroscopische afbeelding analyse. Biofilm culturen duidelijk aanzienlijke niveaus van extracellulaire matrix rondom de cellen en de individuele structuren binnen de biofilm zijn moeilijk te identificeren. Verschillende studies suggereren dat de biofilm levensstijl kan antimicrobiële gevoeligheid 13, 14 beïnvloeden. De kleine schaal ASM assay kan worden zonnepaneel zelfsrmine de BSMIC van meerdere antibiotica meerdere isolaten tegelijk. De werkstroom van de test is in figuur 3. Het effect van antibiotica op de bacteriële levensvatbaarheid van de cellen kan worden gemeten met behulp van de resazurin test. Antibiotica, in dit geval tobramycine, worden toegevoegd aan de bekende biofilm en gedurende 24 uur. Hierna wordt de biofilm wordt verstoord en resazurin wordt toegevoegd. Metabolisch actieve cellen kan de kleurstof resazurin resulteert in een kleurverandering van blauw (resazurin) naar roze (resorufin) 15. Figuur 4A toont een voorbeeld assay waarin P. aeruginosa werd geïncubeerd met verschillende concentraties tobramycine voor biofilm verstoring en toevoeging van resazurin in een microtiterplaat. De blauwe niet-fluorescerende kleur geeft aan niet-levensvatbare cellen, terwijl levensvatbare cellen de kleurstof te reduceren tot de roze tl-vorm, resorufin. De SMIC kan dan worden berekend door het omzetten van fluorescentie in percentageresterende bacteriële leefbaarheid. Figuur 4B toont de verandering in% levensvatbaarheid bij toenemende tobramycine. 10% levensvatbaarheid werd gekozen als een cut-off om het minimumloon verdienen 90 te berekenen. Onder aërobe omstandigheden, de tobramycine SMIC 90 waarden zijn hoger voor de cellen gekweekt als een biofilm dan die van planktonische culturen. Tabel 1 toont de variatie in PSMIC 90 en 90 BSMIC alle geteste stammen. Uit tabel 2 blijkt dat onder aërobe omstandigheden een dramatische toename in resistentie tegen tobramycine (2> 32-voudige toename in SMIC) werd waargenomen voor de meeste isolaten wanneer gekweekt in ASM (biofilm) vergeleken met LB (plankton mode). Bovendien biofilms gekweekt onder omstandigheden Microaërofiele vertoonden een verhoogd SMIC tussen 2 en> 128-voudige opzichte van biofilm gekweekt onder aërobe omstandigheden. Figuur1. Biofilmvorming van P. aeruginosa in ASM P. aeruginosa stam PAO1 vormt macroscopisch zichtbaar pollen (microkolonies) wanneer ze groeien in ASM. A, vorming van biofilm in 30 ml ASM culturen (grootschalige) na 7 dagen de groei in de schroefdop glas Duran kolven. B, biofilmvorming in 2 ml ASM culturen ( kleinschalige) na 3 dagen groei in 24-well polystyreenplaten. Figuur 2. TEM microfoto van ASM biofilms A / C TEM microscoop (x; 27.000) van PAO1 gegroeid planktonically en in ASM, respectievelijk, B / D TEM microfoto (x57, 000) van PAO1grown planktonische en in ASM, respectievelijk. Planktonically gegroeid bacteriën werden gedurende de nacht gekweekt in LB-bouillon. Biofilms werden gekweekt gedurende 7 dagen in 30 ml ASM culturen. Zwarte pijlen verwijzen naar cellen in de biofilm en de sterren verwijzen naar extracellulaire ruimtes. Schaal bars = 1urn. Figuur 3. Workflow van de ASM biofilm antimicrobiële gevoeligheid test. Figuur 4. Gebruik van resazurin voor het bepalen van antibiotica gevoeligheid Bacteriële cellen werden geïncubeerd met verschillende concentraties van het antibioticum de resterende metabolische activiteit werd bepaald met behulp resazurin. A De blauwe niet fluorescerende geoxideerde vorm van resazurin geeft niet-levensvatbare cellen en gereduceerd door metabolische actieve cellen tot roze fluorescerende resorufin. B, wordt fluorescentie-intensiteit omgezet in percentage van de resterende bacteriële levensvatbaarheid. 10% levensvatbaarheid werd gekozen als cut-off om de MSMIC90 te berekenen. Klik hier om lar te bekijkenger figuur. </span> Stammen PSMIC 90 (ug / ml) 1 BSMIC 90 (ug / ml) 1 Aerobic Microaërofiele 2 Aerobic Microaërofiele 2 PAO1 4 4 8 > 512 Liverpool Epidemic Strain (LES) isoleert LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Niet-LES isolaten 49461 16 32 16 > 512 59032 0,5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Tabel 1. Gevoeligheid van P. aeruginosa voor tobramycine. 1 Voor de bepaling van PSMICs en BSMICs tobramycine werd gebruikt in 2-voudige seriële verdunningen variërend 512 tot 0,5 pg / ml (n = 8 voor elke concentratie) en 512-1 pg / ml (n = 4 voor elk concentratie), respectievelijk; PSMICs werden bepaald met behulp van de standaard microverdunningsplaten methode 1. 2 Microaërofiele omstandigheden waren 5% O 2, 10% CO2 en 85% N2. Spannen PSMIC 90 / BSMIC 90 voudige verandering 1 PSMIC aërobe → PSMIC Microaërofiele BSMIC aërobe → BSMIC Microaërofiele PSMIC aërobe → BSMIC aërobe PSMIC Microaërofiele → BSMIC Microaërofiele PAO1 0 > 64 2 128 LES isoleert LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0,25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 </td> 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Niet-LES isolaten 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 </td> 2 > 16 27 2 > 128 0,5 > 32 45 2 > 128 0,25 > 16 Tabel 2. Vouw de verandering van PSMICs en BSMICs voor tobramycine. 1 ND, niet bepaald; waarden in vet geven aan SMIC fold change van> 10.