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면역학 및 감염병학

Misura di attività del Fattore V nel plasma umano usando un saggio di coagulazione Microplate

Published: September 09, 2012
doi:
10.3791/3822
, ,
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science,University of Ontario Institute of Technology , 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences,University of Ontario Institute of Technology , 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences,University of Ontario Institute of Technology

Summary

Questo studio descrive un nuovo metodo di analisi micropiastra che misura l'attività di coagulazione FV durante la formazione di coaguli di fibrina nel plasma umano che non sono state precedentemente riportate. Il metodo utilizza un lettore di micropiastre cinetico per misurare continuamente la variazione di assorbanza a 405 nm durante la formazione di coaguli di fibrina nel plasma umano.

Abstract

In risposta al danno, coagulazione del sangue viene attivato e provoca la generazione della proteasi di coagulazione, la trombina. Trombina scinde il fibrinogeno in fibrina, che forma un coagulo insolubile che si ferma l'emorragia. Fattore V (FV) nella sua forma attivata, FVa, è un cofattore essenziale per la FXa proteasi e acceleratore della generazione di trombina durante la formazione di coaguli di fibrina come parte di protrombinasi 1, 2. Manuali FV saggi sono stati descritti 3, 4, ma sono tempo e personale. Automatizzati saggi FV sono stati segnalati 5-7, ma l'analizzatore e reagenti sono costosi e in genere forniscono solo il tempo coagulo, non la velocità e l'entità della formazione di fibrina. La piattaforma micropiastra è preferito per misurare catalizzate da enzimi eventi della sua convenienza, tempo, costo, piccolo volume, monitoraggio continuo e ad alta velocità 8, 9. Saggi micropiastre sono stati riportati per lisi del coagulo 10, aggregazione piastrinica11, e fattori della coagulazione 12, ma non per l'attività di FV nel plasma umano. L'obiettivo del metodo è di sviluppare un saggio che misura l'attività micropiastra FV durante la formazione di fibrina nel plasma umano.

Questo metodo micropiastra romanzo delinea un saggio semplice, economico e rapido delle attività FV nel plasma umano. Il dosaggio utilizza un lettore di micropiastre cinetico per monitorare la variazione di assorbanza a 405 nm durante la formazione di fibrina nel plasma umano (Figura 1) 13. Il test misura con precisione il tempo, velocità iniziale, e l'estensione della formazione del coagulo di fibrina. Richiede solo quantità pl di plasma, è completa in 6 minuti, ha alta produttività, è sensibile al 24 80pM FV, e misura la quantità di moto involontariamente (1-stadio attività) e trombina-activated FV (2-stadio attività ) per ottenere una valutazione completa della sua attività totale funzionale (a 2 stadi di attività – 1 stadio attività).

Intravas disseminatalare coagulazione (CID) è una coagulopatia acquisita che più spesso si sviluppa da malattie infettive preesistenti 14. DIC è associato ad una prognosi infausta e mortalità aumenta sopra il preesistente patologia 15. Il saggio è stato usato per dimostrare che in 9 pazienti con coagulazione intravascolare disseminata, il FV 1 stadio, 2 stadi, e le attività totali sono diminuite, in media, del 54%, 44%, e 42%, rispettivamente, rispetto umano normale pool riferimento plasma (PHN).

Il saggio FV micropiastra è facilmente adattabile per misurare l'attività di fattore della coagulazione. Questo test aumenterà la nostra comprensione del FV biochimica attraverso una misurazione più accurata e completa della sua attività di ricerca e clinica. Queste informazioni saranno un impatto positivo ambienti sanitari attraverso la diagnosi precoce e lo sviluppo di trattamenti più efficaci per i disordini della coagulazione, come DIC.

Protocol

1. Preparazione di FV-carente plasma umano Questo metodo è una modifica della procedura originariamente descritta da Bloom et al 4. Ottenere sangue umano intero da un volontario consenziente adulto sano (maschio o femmina, età 18 – 50 anni) che non sta prendendo alcun farmaco. Guanti in lattice e un cappotto di laboratorio durante l'intera procedura. Preparare 100 ml di 3,2% (w / v) citrato trisodico in acqua distillata. Caricare 6,0 ml di questa soluzione in 60 ml siringhe separati. Eliminare l'aria dal pistone deprimente con attenzione fino alla tacca 6,0 ml sulla siringa. Utilizzare un tampone imbevuto di alcol per pulire l'area della vena cubitale tra il bicipite e l'avambraccio. Collegare 20 apparecchi farfalla calibro di una siringa da 3 ml. Inserire l'ago a farfalla nella vena cubitale e tirare delicatamente lo stantuffo fino a quando il sangue riempie fino al segno 3 ml. Eliminare la siringa con il sangue. Questa fase viene eseguita per rimuovere qualsiasi fattore tissutale rilasciato dall'endotelio danneggiato in corrispondenza dell'agolesioni sito che può attivare il processo di coagulazione e interferire con la preparazione di FV-carente plasma. Collegare ago a farfalla per siringa da 60 ml 'caricato' con 6,0 ml di citrato trisodico e tirare delicatamente lo stantuffo fino a quando il sangue raggiunge i 60 ml segno sulla siringa. (Concentrazione finale 10.9mm citrato). Rimuovere la siringa da ago a farfalla e mescolare delicatamente la siringa mantenendo un dito guantato o il pollice in uscita siringa. Continua prelievo di sangue in 60 ml siringhe ognuno riempito con 6,0 ml di 3,2% di citrato trisodico come descritto sopra. Si dovrebbe prevedere il recupero di circa il 50% del volume del sangue citrato come plasma dopo centrifugazione e 50 pl di plasma carente di FV è richiesto per campione nel saggio micropiastra. Il nostro laboratorio i processi di routine 300-420 ml di sangue citrato alla volta, utilizzando 5-7 x 60 ml siringhe ciascuna con 6,0 ml di citrato trisodico 3,2% / siringa. Questo è sufficiente FV-carente plasma per circa 3.000 microsaggi piastra (vedi sotto). Rimuovere l'ago a farfalla dal braccio volontario e premere un tampone sterile garza sul sito di puntura venosa per 1,0 min. Copertina sede della puntura della vena con una benda sterile. Centrifugare sangue citrato a 3.300 xg per 20 min a temperatura ambiente. Recupera strato superiore giallo plasma in un recipiente di plastica con un ancoretta con una pipetta di plastica trasferimento facendo attenzione a non disturbare inferiore rosso e bianco strato di cellule del sangue. Misura il volume di plasma in ml e conservare 100 ul di plasma prima di aggiungere EDTA su ghiaccio per il tempo futuro coagulo di protrombina (PT) test (vedi sotto). Aggiungere lentamente solida EDTA di plasma citrato con leggera agitazione a temperatura ambiente per ottenere 5 mM (concentrazione finale). Una volta che l'EDTA è dissolto, aggiustare il pH a 7,0 per aggiunta goccia a goccia di NaOH 1.0M con leggera agitazione. Coprire becher con pellicola trasparente e incubare per 8-10 ore, senza agitazione a 37 ° C. Ogni 2 ore, recuperare il 100 ml diil plasma trattato con EDTA su ghiaccio e determinare il PT al tempo di incubazione con EDTA e confrontare la PT del plasma prima dell'aggiunta EDTA (vedi sopra). Per le determinazioni PT, posto rimovibili 8 strisce immunomodule e nel supporto dima in plastica ed inserirlo nel lettore di micropiastre. Strisce immunomodule Orient in un lettore di micropiastre come: vuoto, vuoto, a campione, vuoto, vuoto, a campione, vuoti, e vuoto da sinistra a destra nel supporto modello per minimizzare le interferenze diffondere la luce dalla vicina campione contenenti strisce. Inoltre, utilizzare solo i pozzetti 2-7 da cima a fondo di ogni nastro 8 immunomodule bene per minimizzare le interferenze diffondere la luce dai bordi del supporto dima in plastica. Il saggio FV micropiastra è in grado di misurare la formazione di coaguli di fibrina in almeno 12 campioni diversi simultaneamente (6 campioni per striscia immunomodule oltre 2 strisce immunomodule). Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 ml di HBS (HEPES 20 mm, 150 mM NaCl, pH 7.4) aciascun pozzetto della micropiastra per ciascuno di campione da analizzare. Utilizzando una pipetta singola, aggiungere 50 ml di umano normale pool di plasma di riferimento (PHN) o al plasma prima dell'aggiunta di EDTA o in tempi diversi di incubazione dopo l'aggiunta di EDTA per separare i pozzetti. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di tromboplastina (Vedi sotto per metodo di preparazione) a tutti i pozzetti con plasma da dosare. Incubare in un lettore di micropiastre a 25 ° C per 1 min e la programmazione del lettore di micropiastre a scuotere la piastra durante il 15-25 sec dell'incubazione 1 min. Uso del computer interfacciato con il lettore per micropiastre, accesso SoftMax Pro software applicativo micropiastra. Impostare il lettore a Assorbanza, lunghezza d'onda di 405nm, modalità Kinetic, la temperatura a 25 ° C, e programmare il lettore per micropiastre a tremare per 5 secondi, e leggere l'assorbanza a 405 nm ogni 5 sec per 6 min. Usando una pipetta multicanale, aggiungere cloruro di calcio (50 ml di 25 mM in acqua distillata; 2.1mm finaconcentrazione l) a tutti i pozzetti, attendere 15 secondi, e premere l'icona 'Start' nel menu di micropiastra SoftMax Pro per iniziare il test. Determinare il TP dai profili di assorbanza in funzione del tempo in SoftMax Pro come il tempo per raggiungere l'aumento di mezzo massimo di assorbanza a 405nm (Il punto medio della curva della Assorbanza sigmoidale Ora prodotta dopo tromboplastina e cloruro di aggiunta di calcio. Vedi sotto, la figura 1). Calcolare il 1 stadio FV attività trovate nella Clot Log (sec) vs Registro attività FV (Unità / ml), come illustrato di seguito nella Figura 2A. Per scopi di quantificazione, 1unità di attività FV è definita come l'attività presente in 1,0 ml NHP prima dell'attivazione intenzionale con aggiunta di trombina (Vedi sotto, analizzando campioni di plasma umano con la FV 1-stadio e 2-stadio saggio coagulazione micropiastra). Preparare 4.0L di HEPES 20mm contenenti 0,15 M di NaCl in acqua distillata con leggera agitazione. Regolare il pH a 7,4 con dropw lentoInoltre ise di 5.0M NaOH (HBS, pH 7.4). Ottenere una lunghezza sufficiente di tubo di dialisi e risciacquare abbondantemente con acqua distillata. Fare un nodo ad una estremità del tubo. Trasferimento EDTA trattati al plasma per tubi di dialisi con una pipetta di plastica trasferimento, rimuovere l'aria, e fare un nodo l'altra estremità del tubo. Attenzione appendere il plasma EDTA-trattati nel tubo nel HBS con leggera agitazione. Coprire con pellicola trasparente e dializza per 14-16h con leggera agitazione a 4 ° C. Rimuovere con attenzione il plasma EDTA-treated/dialyzed in 3.0 ml aliquote in provette con tappo a vite 15,0 ml e conservare 100 pl per il dosaggio di PT 'finale' FV-plasma carente su ghiaccio. Memorizzare il FV-plasma carente in a -80 ° C fino all'utilizzo. Nelle condizioni sopra descritte, l'aumento PTs 10-15 sec prima dell'aggiunta EDTA a 90-100 sec 8-10 ore dopo l'aggiunta di EDTA. La FV-carente plasma preparato da questo metodo contiene routine meno dello 0,1% della presente attivo FV in partenzafresco plasma umano. 2. Preparazione di tromboplastina Dialisi è necessaria per rimuovere qualsiasi calcio da questo reagente per consentire appunto temporizzazione formazione del coagulo di fibrina dal tempo di aggiunta di cloruro di calcio per avviare processo di coagulazione. Preparare 100 ml e 4.0l di HEPES 20 mM e NaCl 0,15 M in acqua distillata in un beaker di plastica con delicata agitazione. Portare il pH a 7,4 con lenta aggiunta goccia a goccia di NaOH 5.0M (HBS, pH 7,4). Aggiungere 6,0 ml di HBS, pH 7,4 ad ogni flacone di reagente tromboplastina, sostituire il coperchio e agitare delicatamente per sciogliere. Incubare reagente in flaconi ridotta per 15 min a temperatura ambiente per sciogliere materiale essiccato. Agitare delicatamente per sciogliere completamente. Tagliare una lunghezza sufficiente di tubo di dialisi, sciacquare bene con acqua distillata, e legare una estremità del tubo con un nodo. Trasferimento tromboplastina al tubo di dialisi, rimuovere l'aria, e legare altra estremità del tubo con un nodo. Carefully appendere tubo di dialisi in 4.0l di HBS, pH 7.4 e mescolare delicatamente coperto con pellicola trasparente a 4 ° C per 14-16 ore. Trasferire 3,0 ml aliquote della tromboplastina dializzata per provette da 15 ml con tappo a vite e conservare a -80 ° C fino all'uso. 3. Preparazione di FV 1-stadio micropiastre coagulazione saggio di attività standard Curve Scongelare FV-carente plasma, NHP, e tromboplastina a 37 ° C per 10 min. Mescolare delicatamente FV-carente plasma e tromboplastina in modo indipendente, il trasferimento di separare plastica vaschette di lavaggio, e incubare in ghiaccio. Conservare la NHP sul ghiaccio, dopo aver leggermente miscelazione. Negozio di cloruro di calcio (25 mM in acqua distillata) in un vassoio separato lavaggio a temperatura ambiente. Preparare 200 pl ciascuna delle diluizioni seriali 2 volte di NHP da 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512 volte in HBS, pH 7,4 con 1,5 ml microcentrifuga tubi. Vortex bene e incubare in ghiaccio. Posizionare rimovibili 8 strisce immunomodule anche in pmodello di supporto lastic e inserirlo nella lettore di micropiastre. Strisce immunomodule Orient in un lettore di micropiastre come: vuoto, vuoto, a campione, vuoto, vuoto, a campione, vuoti, e vuoto da sinistra a destra nel supporto modello per minimizzare le interferenze diffondere la luce dalla vicina campione contenenti strisce. Inoltre, utilizzare solo i pozzetti 2-7 da cima a fondo di ogni nastro 8 immunomodule bene per minimizzare le interferenze diffondere la luce dai bordi del supporto dima in plastica. Il saggio FV micropiastra è in grado di misurare la formazione di coaguli di fibrina in almeno 12 campioni diversi simultaneamente (6 campioni per striscia immunomodule oltre 2 strisce immunomodule). Accendere il lettore di micropiastre e accesso SoftMax Pro software applicativo micropiastra. Usando una pipetta multicanale, effettuare aggiunte simultanee di FV-carente plasma (50 microlitri) a tutti pozzetti campione. Utilizzare una pipetta singola, aggiungere 50 ml di 10 diluizioni seriali di NHP preparati in precedenza per separare i pozzetti. Usando una pipetta multicanale, aggiungere tromboplastina (50 microlitri) a tutti i pozzetti. Incubare nel lettore di micropiastre a 25 ° C per 1 min e la programmazione del lettore di micropiastre a scuotere la piastra durante l'15-25 sec dell'incubazione 1 min. Uso del computer interfacciato con il lettore per micropiastre, accesso SoftMax Pro software applicativo micropiastra. Impostare il lettore a Assorbanza, lunghezza d'onda di 405nm, modalità Kinetic, la temperatura a 25 ° C, e programmare il lettore per micropiastre a tremare per i primi 5 secondi dopo l'aggiunta di cloruro di calcio, e l'assorbanza a 405nm misura ogni 5 secondi per 6 min dopo. L'intervallo di 5 sec agitazione non è incluso nei tempi coagulo calcolati (Vedi sotto). Usando una pipetta multicanale, aggiungere cloruro di calcio (50 ml di 25 mM in acqua distillata; concentrazione finale da 3,5 mm) a tutti i pozzetti del campione, attendere 15 secondi, premere l'icona 'Start' nella domanda di micropiastra in SoftMax Pro dal computer per avviare il dosaggio. Tha tempi di coagulo sono calcolati come il tempo in secondi per raggiungere il punto intermedio tra il minimo e il massimo assorbimento a 405 nm dopo aggiunta di tromboplastina e cloruro di calcio. Le velocità iniziali di formazione del coagulo sono calcolati come tasso di aumento dell'assorbanza a 405nm (mUnits / min), che comprendono i primi 5 punti di tempo di formazione del coagulo nella porzione lineare della curva di assorbanza Tempo. La misura della formazione del coagulo è stato calcolato come differenza tra l'assorbanza massima e minima a 405nm (unità) realizzato durante l'evento formazione del coagulo. 4. Saggio campioni di plasma umano con il FV 1 stadio e 2 stadi Assay coagulazione Microplate Scongelare FV-carente plasma, NHP, plasmi campione, e tromboplastina a 37 ° C per 10 min. Mescolare delicatamente FV-carente plasma e tromboplastina in modo indipendente, il trasferimento di separare plastica vaschette di lavaggio ELISA, e incubare in ghiaccio. Conservare i plasmi NHP e del campione su ghiaccio, dopo aver leggermente miscelazione. Negozio di cloruro di calcio (25 mM in acqua distillata) in un apposito cassetto lavaggio ELISA a temperatura ambiente. Preparare 200 pl ciascuna delle 40 diluizioni dei plasmi NHP e del campione in HBS, pH 7.4 utilizzando provette da 1,5 ml microcentrifuga. Vortex bene e incubare in ghiaccio. Inserire rimovibili 8 strisce immunomodule e nel supporto dima in plastica e inserire nel lettore di micropiastre. Strisce immunomodule alternativo vuoto, vuoto, campione, vuoto, vuoto, campione, vuoti, e vuoto da sinistra a destra nel supporto modello per minimizzare le interferenze diffondere la luce dalla vicina campione contenenti strisce. Usare solo i pozzetti 2-7 da cima a fondo in ogni striscia immunomodule per minimizzare le interferenze diffondere la luce dai bordi del supporto dima in plastica. Accendere il lettore di micropiastre e accesso SoftMax Pro software applicativo micropiastra. Usando una pipetta multicanale, aggiungere FV-carente plasma (50 microlitri) a tutti pozzetti campione. Utilizzo di un single pipetta, aggiungere 50 ml di 40 volte NHP diluito o plasma campione preparato in precedenza per separare i pozzetti. Usando una pipetta multicanale, aggiungere tromboplastina (50 microlitri) a tutti i pozzetti. Incubare nel lettore di micropiastre a 25 ° C per 1 min e la programmazione del lettore di micropiastre a scuotere la piastra durante l'15-25 sec dell'incubazione 1 min. Uso del computer interfacciato con il lettore per micropiastre, accesso SoftMax Pro software applicativo micropiastra. Impostare il lettore a Assorbanza, lunghezza d'onda di 405nm, modalità Kinetic, la temperatura a 25 ° C, e programmare il lettore per micropiastre a tremare per i primi 5 secondi dopo l'aggiunta di cloruro di calcio, e l'assorbanza a 405nm misura ogni 5 secondi per 6 min dopo. L'intervallo di 5 sec agitazione non è incluso nei tempi coagulo calcolati (Vedi sotto). Usando una pipetta multicanale, aggiungere cloruro di calcio (50 pl di 25 mM in acqua distillata; 6.25mm concentrazione finale) per tutti i pozzetti campione e immediatamente prEss l'icona 'Start' nella domanda di micropiastra in SoftMax Pro dal computer per avviare il test. Al termine della corsa, determinare il tempo, velocità iniziale, e l'entità della formazione del coagulo per 40 volte di NHP campione diluito e plasmi dai profili di assorbanza rispetto al tempo in SoftMax Pro. Tenendo conto della diluizione di 40 volte, utilizzare il tempo di coagulo per ciascun campione per calcolare l'attività FV in Unità / ml dal FV 1-stadio curva di attività di tempo standard Log Clot vs Registro attività FV (Figura 2A). Questo rappresenta l'attività FV-1 stadio o che senza attivazione 'intenzionale' di trombina. Poiché FV viene attivato con trombina attiva il cofattore, FVa 1, un secondo saggio dopo l'aggiunta e incubazione con trombina è fondamentale per misurare accuratamente il 2-stadio attività FV di un campione di plasma (con attivazione 'intenzionale' di aggiunta trombina). Per il 2 stadi saggio FV, preparare 200-300 ml di trombina purificata 18 bist 100nm HBS, pH 7,4 e incubare in ghiaccio. Prevede di utilizzare 10 ml di trombina diluita per ciascun campione di plasma da analizzare con il 2-stadio saggio FV. Diluire 120 microlitri della NHP sopra e plasmi campione da 40 volte a 100 volte con 170 microlitri di HBS, pH 7,4 contenente 2,8 cloruro di calcio. Aggiungere 10 microlitri di trombina (10 nM concentrazione finale) per ogni campione. Vortice bene per mescolare e incubare a 37 ° C per 1 min. Diluire NHP e plasmi campione a 500 volte con l'aggiunta di 400 pl di HBS, pH 7,4, vortice bene, e dosaggio 50 pl di ciascun campione di plasma nel FV 1-stadio micropiastra saggio come descritto sopra. Determinare il tempo di coagulo per NHP e ciascun campione di plasma analizzato dai profili di assorbanza in funzione del tempo in SoftMax Pro. Tenendo conto della diluizione 500 volte, utilizzare il tempo di coagulo per ogni campione per calcolare il FV a 2 stadi attività dal FV 1-stadio curva standard del Tempo Log Clot vs Registro attività FV (Figura 2A). Il totale FV le attivitàty può quindi essere calcolata come FV a 2 stadi di attività – FV 1-fase di attività.

Representative Results

Rappresentante dei risultati – Preparazione del FV 1-stadio micropiastra coagulazione saggio curve standard di attività Un esempio rappresentativo di formazione del coagulo di fibrina nel saggio FV nel tempo generato dal lettore di micropiastra è illustrato nella figura 1. Il saggio FV misura con precisione il tempo, velocità iniziale, e l'estensione della formazione del coagulo di fibrina. Ispezione dei pozzetti dopo il completamento del test ha confermato che la formazione del coagulo è verificato. Tutte le reazioni raggiunto approssimativamente la stessa misura della formazione del coagulo con un generale cambiamento di assorbanza a 405 nm di 0,35-0,45 unità tra l'assorbanza iniziale prima e l'assorbanza massima dopo tromboplastina aggiunta di calcio e cloruro. Esempi rappresentativi di FV 1-stadio le curve di attività di tempo standard Log Clot (in secondi) vs Registro attività FV (Unità / ml) e Log velocità iniziale di formazione del coagulo (in mUnits / min) vs Registro attività FV (Unità / ml ) per diluizioni seriali di NHP è mostrata nella <strong> Figura 2A e la Figura 2B, rispettivamente. Montaggio del log-log plot del tempo Clot vs FV 1-Attività indicato una forte relazione tra queste variabili, dopo l'analisi di regressione lineare (Figura 2A, R 2 = 0,980). Montaggio del log-log grafico della velocità iniziale di formazione del coagulo vs Attività FV anche indicato una forte relazione tra queste variabili, dopo l'analisi di regressione lineare (Figura 2B, R 2 = 0,983). Il rapporto di entrambi Tempo Clot Log e Log velocità iniziale di formazione del coagulo vs Registro attività FV rimasta lineare per NHP diluito fino a 512 volte. Dal FV circola in NHP a circa 12-40nm 16, il saggio micropiastra è sensibile a circa 24 80pM FV in NHP. Dato che la costante dell'interazione di FVa-FXa-lipide in protrombinasi dissociazione è di circa 1 nM 17, il saggio FV micropiastra è interamente adatto per la misurazione dei livelli di FV nel fisiologicamente relevant gamma nM per la funzione FVa in protrombinasi. Utilizzando il test FV micropiastra, è stato anche stabilito che la normale gamma di attività FV in 1 stadio saggio di attività FV di 15 plasmi di controllo sani (Maschio e Femmina, Età 18-20yrs) era (media ± deviazione standard; Range): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Questo ben si accorda con la normale attività sana FV e la gamma (0.66-1.14U/ml) riportata da Cutler et al. per il FV 1-stadio dell'attività determinata con un analizzatore automatico 7. La variabilità intra-analisi della misura del tempo, e la velocità iniziale di formazione di coaguli nel 1 stadio saggio FV in 6 pozzetti su 8 diversi giorni è stata del 3,4%, 4,4%, e 3,1%, rispettivamente. La variabilità inter-analisi della misura del tempo, e la velocità iniziale di formazione di coaguli nel 1 stadio saggio FV in 6 pozzetti di 8 diversi esperimenti su 8 giorni diversi è stato del 7,1%, 7,8% e 9,2%, rispettivamente. Pertanto, la variabilità intra-ed inter-saggio di queste tre misuvariabili rosse era ad un livello basso e accettabile per le prestazioni del dosaggio solida all'interno e tra i test micropiastra di campioni contemporaneamente (fino a 12). Rappresentante Risultati – Saggio campioni di plasma umano con il FV 1 stadio e 2 stadi saggio di coagulazione micropiastra La curva standard di Grumo Log Tempo vs Registro attività FV (Figura 2A) è stato utilizzato per misurare l'attività FV in NHP e 9 DIC plasma dei pazienti che non sono stati intenzionalmente attivati ​​con l'aggiunta di trombina (FV 1-stadio attività) o sono stati intenzionalmente attivati ​​con aggiunta trombina (FV due stadi attività) ed i risultati sono mostrati nella Tabella 1. Tutti i 9 DIC plasma dei pazienti esposti FV 1-stadio attività e tassi iniziali della formazione del coagulo, che sono diminuiti in media, del 54% e 18%, rispettivamente, da NHP. Le estensioni di formazione di coaguli nel 1 stadio FV dosaggio nei pazienti con CID non erano molto diversi dai NHP, e sono aumentati in media, del 13% da NHP. Attivazione di NHP con trombina generato un approssimativo di 8 volte aumento di FV a 2 stadi di attività al di sopra del 1 stadio attività FV (Tabella 1). Ciò indica che il FV in NHP è principalmente presente nella sua forma disattivo e concorda con i risultati riportati in precedenza con inclinazione manuale-tube test FV 3, 4 e automatizzati saggi FV 5-7. Il FV a 2 stadi e l'attività totale, erano diminuiti nei pazienti DIC in media, del 44% e 42%, rispettivamente, da NHP. Le tariffe iniziali e le estensioni di formazione di coaguli nel FV a 2 stadi dosaggio nei pazienti DIC non erano significativamente differenti da NHP, e varia in media, di circa il 9% e 4%, rispettivamente, da quella osservata con NHP. Questi risultati indicavano che rispetto al FV in NHP, la FV nei plasmi paziente DIC determinato un tempo prolungato e ridotta velocità di formazione del coagulo di fibrina e che il paziente FV era in media, solo il 56% come attivabile con trombina pure. ent "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 1. Formazione di coaguli nel normale pool di plasma umano di riferimento misurato con la cinetica micropiastra FV 1-fase di test della coagulazione. Formazione di coaguli di fibrina in NHP è stata continuamente monitorata a 405 nm usando un lettore di micropiastre cinetica. La trama è l'uscita del lettore per micropiastre di reazione 6 min di 32 volte NHP diluita, FV-carente plasma, tromboplastina, e cloruro di calcio in una micropiastra. L'asse verticale rappresenta il cambiamento di assorbanza a 405nm avvenuti a seguito della formazione di fibrina nel plasma. Il tempo di formazione della fibrina è stata definita come il tempo per raggiungere il massimo incremento di assorbanza mezzo o il punto centrale della curva (36,40 sec). Il tasso iniziale di formazione del coagulo è stato definito come il tasso di variazione di assorbanza a 405nm nei primi 5 punti temporali del aumento lineare della porzione di assorbanza della curva (611,88 mUnits / min). La valutazione extenda di formazione del coagulo è stato definito come la differenza tra l'assorbanza massima e minima a 405 nm (0,35 unità). Figura 2. Curve standard di tempo e di velocità iniziale di formazione del coagulo vs V Fattore di attività nel normale pool di plasma umano di riferimento con il FV 1-fase di test micropiastra. NHP è stato diluito serialmente (0 – a 512 volte in HBS) e dosati con il FV 1-fase di test micropiastra come descritto nel protocollo. Log-Log trame del tempo e la velocità iniziale di formazione del coagulo contro l'attività nel FV FV 1-fase di test micropiastra sono visualizzabili i modelli di regressione lineare dei dati nei pannelli A e B, rispettivamente. Campione 1 stadio Attività saggio (Unità / ml) 1 stadio Estensione test (unità) <td> 1-fase di analisi Velocità iniziale (mUnits / min) 2 stadi di attività test (Unità / ml) A 2 stadi Portata test (unità) 2 stadi Vota test iniziale (mUnits / min) L'attività totale (Unità / ml) NHP 1,02 0,363 744,96 7,93 0,433 375,84 6,91 Paziente 1 0,36 0,404 583,80 3,84 0,432 249,96 3,48 Paziente 2 0,67 0,416 704,04 5,28 0,469 323,16 4,61 <strong> Paziente 3 0,31 0,435 562,08 3,92 0,453 294,96 3,61 Paziente 4 0,39 0,435 617,04 4,14 0,462 372,60 3,75 Paziente 5 0,73 0,401 641,40 5,91 0,433 354,24 5,18 Paziente 6 0,45 0,403 600,72 4,16 0,445 393,96 3,71 Paziente 7 0,49 0,395 575,40 4,89 0,449 357,48 4,40 Paziente 8 0,19 0,448 489,00 2,89 0,450 330,48 2,70 Paziente 9 0,64 0,423 699,48 5,11 0,455 417,24 4,47 Tabella 1 Attività FV in NHP e in 9 pazienti che hanno sviluppato coagulazione intravascolare disseminata (CID). L'FV 1 stadio, 2 stadi, e l'attività totale in NHP e 9 DIC plasma dei pazienti sono stati determinati dalla FV 1-stadio micropiastra saggio standard curva del tempo di formazione del coagulo vs attività FV (Figura 2A) e sono espressi in Unità / ml. Le tariffe iniziali (tasso iniziale di incremento A405nm su primi cinque punti di orario di mUnits / min) ed estensioni (Massimo A405nm – minimo A405nm) di formazione di coaguli nel FV 1 – e 2-fase di test vengono visualizzati anche micropiastra.

Discussion

Il metodo di analisi cinetica micropiastra descrive lo sviluppo di un romanzo, tecnica rapida, economica e conveniente per la misurazione dell'attività di coagulazione FV in campioni di plasma umano che non hanno (FV 1-stadio assay) o sono stati intenzionalmente attivato con aggiunta di trombina (FV 2 stadi saggio). Il dosaggio utilizza un lettore di micropiastre cinetico e tutti i materiali e reagenti necessari sono disponibili in commercio o possono essere realizzati internamente. Il dosaggio controlla continuamente la variazione della diffusione luminosa del plasma durante la formazione del coagulo di fibrina a 405 nm. Il dosaggio micropiastra ha il vantaggio di utilizzare piccoli volumi di campione di plasma (microlitri) ed è riconducibile per l'analisi di campioni multipli contemporaneamente (fino a 12). Questi attributi del saggio sono vantaggiosi quando costose attrezzature e reagenti vengono utilizzati (analizzatori automatici e Factor-deficient plasma); solo piccole quantità di campione sono disponibili (plasmi paziente) o di un grande numero di campioni (f Durante purificazione FVrom plasma).

Il saggio FV micropiastra ha i vantaggi aggiunto che è conveniente, veloce e non richiede l'isolamento e la purificazione dei componenti costitutivi richiesti. Rispetto manuale tilt-tubo 3, 4 e 5-7 FV saggi automatizzati che sono stati riportati, il dosaggio FV micropiastra è paragonabile gamma utile di volte coagulo (25-75 sec) e corrispondenti livelli FV nel campione (0,5-0,005 Units / ml), e la sensibilità / limiti di rivelazione (20-80pM). Rispetto manuali tilt-tube saggi FV che soffrono di una valutazione soggettiva visiva della formazione del coagulo 3, 4, il saggio FV micropiastra consente la misurazione oggettiva e quantitativa del tempo di coagulo, velocità iniziale, e l'entità della formazione del coagulo di fibrina. Rispetto ai test automatizzati FV che soffrono dal requisito di analizzatori costosi e reagenti 5-7, i reagenti micropiastre saggio FV e materiali sono economici e tutti i materiali necessari possono essere acquised o resi in-house. Manuale tilt-tubo 3, 4 e saggi automatizzati 5-7 FV generalmente forniscono solo il tempo di formazione del coagulo, non il tempo, velocità iniziale, e l'entità della formazione del coagulo di fibrina che sono tutti accuratamente misurata spettrofotometricamente con il test FV micropiastra. Infine, saggi 5-7 manuale tilt-tubo 3,4 e automatizzata FV soffrono solo essere in grado di misurare l'attività FV in campioni di plasma, una alla volta, mentre il saggio FV micropiastra è suscettibile di alta produttività e 12 campioni possono essere dosati simultaneamente.

Il dosaggio micropiastra è stata usata per dimostrare che il FV in 9 pazienti plasmi DIC era meno attiva rispetto NHP causa di una combinazione di volte coagulo ritardati e tassi più bassi iniziali della formazione del coagulo in uno stadio dosaggio FV. Le velocità iniziali di formazione del coagulo in due stadi FV saggio nei plasmi DIC paziente non sono stati modificati da NHP. Le estensioni di formazione di coaguli nel patien DICt plasmi sono stati, inoltre, non cambiato da NHP nel FV 1 stadio e 2 test monofase. Diminuzione FV 1 stadio, 2 stadi, e le attività totali può essere dovuto ad un aumento dei consumi FV 19 e / o l'inattivazione di 6, secondo altri studi durante la patogenesi di questa malattia del sangue acquisito. Data l'entità della formazione del coagulo nel plasma DIC era lo stesso osservato con NHP, questa variabile era probabilmente a causa della concentrazione di fibrinogeno nel plasma FV-carente e non correlati alle caratteristiche dei plasmi paziente.

I risultati del saggio micropiastra indicato che la misurazione dell'attività FV in campioni di plasma umano può essere ottenuto dal tempo e frequenza iniziale di formazione del coagulo dal 1 stadio FV dosaggio e il tempo di formazione del coagulo e attività totale della FV 2 – fase di test. Non è stato possibile ottenere la misura quantitativa dell'attività FV in un campione di plasma basate sulla misura della formazione del coagulo in tegli FV 1 – e 2-test monofase o il tasso iniziale di formazione di coaguli nel FV a 2 stadi saggio. Dato tutte le reazioni raggiunto approssimativamente la stessa misura della formazione del coagulo di 0,35-0,45 unità tra l'assorbanza iniziale prima e l'assorbanza massima dopo tromboplastina e cloruro di calcio Inoltre, la misurazione del grado di formazione del coagulo non fornisce una valutazione quantitativa dell'attività FV in dato campione di plasma.

Il saggio micropiastra romanzo troveranno impiego nella ricerca e cliniche per la misurazione dell'attività FV in campioni di plasma umano e frazioni durante la sua purificazione dal plasma umano e animale. Il saggio micropiastra può essere usato per misurare il tempo, velocità iniziale, e l'entità della formazione del coagulo; parametri generalmente non controllati simultaneamente in manuali tilt-tube saggi e analizzatori di coagulazione automatizzati. Questa informazione fornisce più di una valutazione quantitativa completa del coinvolgimento FV durante l'evento formazione del coagulonel plasma umano che è stato precedentemente riportato 3-7. Questa informazione è particolarmente importante sia nella ricerca e nei laboratori clinici quando si misurano variazioni significative dell'attività FV in campioni di plasma o con purificato FV o FVa. Il dosaggio FV micropiastra può anche essere utilizzato per caratterizzare e misurare composti che possono attivare o disattivare FV e FVa, misurare l'attività FV in pazienti a rischio di trombosi venosa come risultato della mutazione FV Leiden 20, 21 e per monitorare l'attività di FV durante la sua purificazione dal plasma.

Il saggio FV micropiastra è facilmente adattabile per misurare l'attività di fattore della coagulazione del estrinseca, via intrinseca, o comuni utilizzando l'apposito fattore carente di plasma e l'avvio di reagenti per la formazione di fibrina. Il saggio aumenterà la nostra comprensione del FV biochimica attraverso una misurazione più accurata e completa della sua attività nel campo della ricerca e nei laboratori clinici. Finalely, queste informazioni avrà un impatto positivo ambienti sanitari attraverso la diagnosi precoce e lo sviluppo di trattamenti più efficaci per gli individui affetti da disturbi della coagulazione, come DIC.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La ricerca è stata sostenuta con sviluppo professionale e dei fondi di ricerca di avvio presso l'Università dell'Ontario Institute of Technology (UOIT) per Dr. John A. Sami e Istituti canadesi di premio Salute Ricerca Ricerca professionale dello studente a Irina Levit. Gli autori riconoscono Shannon Everett (Teaching and Learning Centre, UOIT) per il suo aiuto la preparazione del video. Gli autori riconoscono Dr. Michael E. Nesheim (Dipartimento di Biochimica, Queen 's University, Kingston, ON) per il suo mentore, l'intuizione, e le utili discussioni. Gli autori riconoscono anche il Dr. Cheng Hock Toh (Roald Dahl Emostasi e Trombosi Centro, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, UK) per la fornitura dei plasmi paziente DIC utilizzati nello studio.

Materials

Name of reagent Company Catalogue number Comments (Optional)
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.
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References

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Factor V ActivityHuman PlasmaMicroplate Coagulation AssayBlood CoagulationThrombinFibrinogenClot FormationProthrombinaseFV AssaysAutomated FV AssaysMicroplate PlatformEnzyme-catalyzed EventsClot LysisPlatelet AggregationCoagulation FactorsFV Activity MeasurementKinetic Microplate ReaderAbsorbance Change At 405nm

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Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).
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