شاشة الوراثية لعزل التوكسوبلازما جوندياي المسوخ الخروج المضيف الخلية
Summary
تقدم علم الوراثة هو وسيلة قوية لكشف المستوى الجزيئي لكيفية<em> التوكسوبلازما</em> المخارج من الخلية المضيفة لها. وتقدم بروتوكولات mutagenize كيميائيا الطفيليات، وإثراء لالمسوخ مع العيوب التي يسببها في الخروج، والتحقق من صحة النمط الظاهري من المسوخ المستنسخة.
Abstract
، وتلزم على نطاق واسع داخل الخلايا، طفيل بروتوزوا المقوسة الغوندية يسبب مرض الانتهازية في المناعية للخطر المرضى ويسبب تشوهات خلقية على العدوى الخلقية. وتتميز دورة النسخ المتماثل التحللي من ثلاث مراحل: 1. نشط غزو خلية المضيفة الأنوية، 2. تكرار داخل الخلية المضيفة، 3. نشط الخروج من الخلية المضيفة. وعلى نحو متزايد آلية الخروج يجري تقديره بوصفه عملية فريدة من نوعها، تنظيما، والتي لا تزال غير مفهومة على المستوى الجزيئي. وقد اتسمت مسارات الإشارات الكامنة وراء الخروج من خلال استخدام وكلاء الدوائية تعمل على جوانب مختلفة من مسارات 1-5. على هذا النحو، وقد تم تحديد عدة مشغلات مستقلة من الخروج التي تتلاقى كل على اطلاق سراح الكالسيوم داخل الخلايا 2 +، إشارة إلى أن من المهم أيضا للغزو الخلية المضيفة 6-8. وأبلغت هذه الرؤية نهج الجين مرشح الذي أدى إلى identiتقويتها من النباتات مثل الكالسيوم بروتين كيناز تعتمد (CDPK) تشارك في الخروج 9. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحقيق اختراقات عديدة مؤخرا في الخروج التفاهم باستخدام (مادة كيميائية) النهج الوراثية 10-12. من الجمع بين وفرة المعلومات الدوائية مع إمكانية الوصول الوراثية المتزايدة للالتوكسوبلازما أنشأنا مؤخرا على شاشة السماح لتخصيب اليورانيوم لالمسوخ طفيلي مع وجود خلل في خروج الخلية المضيفة 13. على الرغم من استخدام الطفرات الكيميائية باستخدام N-إيثيل-N-nitrosourea (ENU) أو إيثيل methanesulfonate (EMS) لعقود من الزمان في دراسة علم الأحياء التوكسوبلازما 11،14،15، إلا في الآونة الأخيرة ورسم الخرائط الوراثية من الطفرات الكامنة وراء الظواهر تصبح روتينية 16 -18. وعلاوة على ذلك، من خلال توليد الحرارة حساسة المسوخ، يمكن تشريح العمليات الأساسية والجينات الكامنة التي تم تحديدها مباشرة. هذه المسوخ تتصرف كما نوع البرية تحت درجة حرارة متساهلة (35 درجة مئوية)، لكنه يفشل في فroliferate في درجة الحرارة تقييدا (40 درجة مئوية) وذلك نتيجة للطفرة في السؤال. نحن هنا لتوضيح طريقة جديدة لعزل الفحص المظهري المسوخ مع النمط الظاهري الخروج حساسة للحرارة 13. والتحدي الذي يواجه شاشات الخروج هو الفصل egressed من غير egressed طفيليات، وهي مسألة معقدة بسبب بسرعة إعادة غزو والحساسية العامة للطفيليات إلى الخلايا المضيفة. واستند شاشة الخروج المحددة سابقا على سلسلة معقدة من الخطوات للفصل بين الخلايا biotinylation من طفيليات خارج الخلية 11. هذا الأسلوب أيضا لم تولد المسوخ الشرطي مما أدى إلى ضعف الظواهر. الطريقة الموضحة هنا يتغلب على تعلقه الشديد من egressing الطفيليات بما في ذلك من قبل منافس غليكان، كبريتات ديكستران (DS)، الذي يمنع الطفيليات من الالتصاق إلى الخلية المضيفة 19. وعلاوة على ذلك، يتعرضون للقتل على وجه التحديد طفيليات خارج الخلية قبالة عن طريق dithiocarbamate بيروليدين (PDTC)، الذي يترك الطفيليات داخل الخلايادون أن يصاب بأذى 20. لذلك، مع شاشة المظهري جديدة لعزل تحديدا المسوخ طفيلي مع عيوب في الخروج الناجم، ويمكن الآن قوة علم الوراثة يمكن نشرها بالكامل لكشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء خروج الخلية المضيفة.
Protocol
Discussion
بروتوكول وصف يوفر وسيلة فعالة لعزل المسوخ التوكسوبلازما مع عيب الخروج. لقد نجحنا في عزل المسوخ على طول خطوات مختلفة لمسار الخروج، وبعضها لديها النمط الظاهري غزو المزدوج 13. ويمكن تحديد الآثار المحتملة على الغزو باستخدام ما يسمى الأحمر والأخضر الفحص، ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل علماء الرابطة الأمريكية 0635480N القلب منح التنمية والمعاهد الوطنية للصحة منحة بحثية AI081220. وتدعم الهيئة من قبل العين فرسان منحة مؤسسة أبحاث.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher & Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective |
HBSSc (according to Black et al.11):
- 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
- 100 μl 1M MgCl2 (100 mM end)
- 100 μl 1M CaCl2 (100 mM end)
- 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
- 84 mg NaHCO3 (10 mM end)
References
- Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii. Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).
- Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii. J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).
- Silverman, J. A. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).
- Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole. Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).
- Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin. Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).
- Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages. Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).
- Hoff, E. F., Carruthers, V. B. Is Toxoplasma egress the first step in invasion. Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).
- Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii. J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).
- Lourido, S. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
- Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation. J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).
- Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress. Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).
- Chandramohanadas, R. Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells. Science. , (2009).
- Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
- Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants. Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).
- Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship. Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).
- Striepen, B. Genetic complementation in apicomplexan parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).
- White, M. W. Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant. Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).
- Gubbels, M. J. Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).
- Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment. Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).
- Camps, M., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate. Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).
- Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).
- Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).
- Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion. J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).
- Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).
- Kafsack, B. F. Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells. Science. 323 (5913), 530-533 (2009).
- Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).
- Nagamune, K. Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii. Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).
- Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection. J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).
- Persson, E. K. Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii. J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).
