Использование специфических гликозидазы удалить сахара из гликопротеинов следуют SDS-PAGE является ценным методом для обнаружения гликана модификаций на белок образцов и является хорошим выбором для первоначального исследования гликобиологии. Изменения, произошедшие в Дегликозилирование могут быть обнаружены как сдвиги в геле подвижность или окрашиванием гликана чувствительных реагентов.
Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified (“high mannose N-glycans”) or are further processed in the Golgi (“complex N-glycans”). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCGβ), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), β1-4 Galactosidase, and β-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3,6 Galactosidase, and β1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 μg), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.
Описанный здесь метод использования ферментативных Дегликозилирование и SDS-PAGE может дать ценную информацию о состоянии гликозилирования белков представляет интерес, в то время как гликана-специфических реагентов облегчить интерпретацию данных. Этот протокол предназначен для первоначальных исследований гликозилирования белков, и это особенно хорошо подходит для секреторной и мембранные гликопротеины из клеток млекопитающих: ферменты выбрали в этом случае будет специально удалить все N-гликанов, и или N-гликанов плюс и самый распространенный сахар расширение и формирование ядра О-гликанов. Гликозидазы имеют дополнительное преимущество мягкий, по сравнению с химическими методами Дегликозилирование, сохранения целостности обоих сахаров и белков позвоночника.
Для выяснения показатель заполненности (что аминокислоты гликозилированного), степень гликозилирования, или для определения тонкой структуры гликанов, более сложные методы, такие как мзад-спектрометрии, жидкостной хроматографии и ЯМР обязательны для заполнения.
Из-за своей простоты, несколько шагов в этом протоколе можно отрегулировать, заменить и / или в комбинации для размещения различных экспериментальных потребностей. Однако, для того, чтобы получить результаты, которые могут быть четко интерпретировать важно понимать свои сильные стороны и ограничения. Во-первых, специфичность и чистоту гликозидазы имеют решающее значение: только хорошо известных ферментов, проходят проверку на отсутствие протеаз и других загрязняющих деятельности должны быть использованы. К сожалению, не существует стандартного определения единицы фермент для гликозидазы, пользователь должен определить соответствующие замены в соответствии со спецификацией производителя. Во-вторых, тщательный выбор обнаружения необходимо: а) реагентов белка окрашивания полезны, только если Дегликозилирование приводит к значительному сдвигу в молекулярной массой. Такой четкий результат, как показано здесь, не всегда получается. В других случаях мы видели ненормальных мильgration после Дегликозилирование (далеко не предсказал молекулярный вес, или еще медленнее, миграция). Это явление не очень хорошо понимал, но можно сказать, что любые изменения в миграционной доказательства того, что белок deglycosylated. Б) Сахар обнаружения с антителами представляет уникальные задачи, что ограничивает их применение. Это было очень трудно произвести общий анти-гликана антител; они, как правило, выдвигаемые против комплексной целевой гликана, что ограничивает их использование. Кроме того, несколько моноклональных анти-гликана антител дисплей нежелательных перекрестной реактивности 10. В) лектинов (белки с внутренней близости сахара) хорошо подходят для обнаружения сахара, плюс они дают представление о структуре гликана. Однако, не все из них имеют узкую специфику, и многие из них лишь частично охарактеризованы (это означает, что они, возможно, неизвестные сродство). Как следствие положительное окрашивание лектин обеспечивает индикацию, а не доказательства, о присутствии гиВен сахара. г) Химическая маркировка комплектов (на основе периодатом окисление сахаров) методом выбора для окрашивания всех гликопротеинов, и таким образом хорошо подходит следовать Дегликозилирование.
При обработке неизвестного образца, это хорошая практика, чтобы включить гликопротеин управления. Fetuin является доступной N – и О-гликопротеин, хорионический гонадотропин (оба подразделения) также является хорошим выбором. Бычий сывороточный альбумин (BSA), могут быть использованы в качестве отрицательного контроля. Однако следует отметить, что некоторые негликозилированные белки реагируют слегка Pro-Q Изумрудный 300, особенно при использовании в высоких концентрациях. Негликозилированные молекулярного веса стандартов, таких как prestained маркерный белок, используемые в настоящем протоколе, имеют то преимущество, отображающий резкие полосы. Лишь по случайности один из этих белков (80 кДа) реагирует на Pro-Q Изумрудный 300. Таким образом, пользователь может понадобиться запустить лестнице гликопротеин стандартных, а не, например, конфеты-Кане от Invitrogen.
Наконец, просто в-гель обнаружения nucleocytosolic гликопротеины (которые изменяются с одним О-GlcNAc) возможно с использованием моноклональных антител, а также β-N-Acetylglucosaminidase за специфики управления 11. Описание этой техники находится за пределами рамки данной статьи, но она должна быть упомянутым в качестве гликозидазы являются полезным инструментом для изучения многих других гликопротеинов и гликоконъюгатов присутствуют в клетках. Комплексное лечение всех известных форм гликозилирования могут быть найдены в второе издание "Основы гликобиологии" и доступен бесплатно онлайн на книжной полке NCBI (Книжная полка ID: NBK1908; PMID: 20301239) 12.
The authors have nothing to disclose.
Расческа Дону
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human chorionic gonadotropin β | Sigma Aldrich | C6572 | |
PCR Tubes | VWR | 20170-004 | |
PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10% NP-40 | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |