특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

1. 효소 deglycosylation 증발에 의한 수분 손실을 최소화하기 위해 PCR 튜브를 사용하십시오. 튜브 1 7 라벨 한 세트. 10X G7 버퍼, 10X 당단백질 denaturing 버퍼, 그리고 10 % NP – 40을 녹여 부드럽게 내용을 혼합하기 위해 튜브를 누릅니다. 상온에서 보관. 얼음에 효소 함유 튜브를 삽입합니다. 해동 / 정지 사이클을 최소화하기 위해보십시오. DH 2 O 600 μl에 hCGβ 유리병 (150 μg)의 내용을 해산하고 얼음에 보관. DH 2 O.에서 10X 주식을 diluting하여 1X G7 버퍼 1 ML 준비 25 μl 1X G7 버퍼에 PNGase F 0.5 μl를 희석하여 얼음 계속. 2 μl α – N – Acetylgalactosaminidase 각, α1 – 2 Fucosidase, β1 – 3 갈락토 및 α1 – 3, 6 갈락토를 결합하여 exoglycosidase 믹스 (예 혼합) 준비합니다. 표시된로 PCR 튜브를 설정합니다 : AK "> 튜브 / 샘플 # 일 이 3 4 5 6 7 hCGβ (0.25mg/ml) 9μl 9μl 9μl 9μl – – – 10X 당단백질는 버퍼 Denaturing 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl DH 2 O – – – – 9μl 9μl 9μl 튜브를 대장,에 부드럽게 믹스 및 장소thermocycler는 뚜껑을 닫고 94시 10 분 잠복기하여 단백질을 변성 ° 4 ° C 개최 다음 C (thermocycler에서 PCR 튜브를 사용하여 크게 소량의 샘플의 증발을 방지). thermocycler에서 튜브를 제거하고 눈에 보이는 결로를 제거하는 원심 분리기. 표시된대로 다음과 같은 시약을 추가합니다 : 샘플 # 일 이 3 4 5 6 7 10% NP – 40 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 10X G7 버퍼 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5 & 뮤; 리터 2.5μl PNGase F 1시 50분 dil. – 2μl – – 2μl – – Deglycosylation 믹스 – – 2μl 2μl – 2μl 2μl EG 믹스 – – – 2μl – – 2μl DH 2 O 10μl 8μl 8μl 6μl 8μl 8μl 6μl 총 반응 권. 25 μ의 리터 25 μ의 리터 25 μ의 리터 25 μ의 L </ TD> 25 μ의 리터 25 μ의 리터 25 μ의 리터 새로운 모자를 (그들은 하나의 인큐베이션 사이클 후에 제대로 맞지 않기 때문에 사용하는 것들을 버리고)를 사용하여 PCR 튜브를 닫습니다. 부드럽게 4 번 감청 다음 내용을 아래 스핀하여 튜브를 섞는다. 4 시간 ° C가 다음 4 ° C.에 샘플을 냉각 37 thermocycler과 부화에 튜브를 삽입 2. deglycosylated 샘플 SDS – PAGE 1.25M DTT 4 μl를 추가하여 130 μl 신선한 배 감소 SDS 로딩 버퍼를 준비합니다. 각 샘플에 대한 준비가 배 감소 SDS 로딩 버퍼의 12.5 μl를 추가합니다. 새로운 모자와 튜브를 닫고 부드럽게 섞어 튜브를 누릅니다. 94에서 thermocycler에 튜브를 품어 ° C 4 ° C.에 냉각 후 5 분에 대한 각 시료 30 μl와 10~20% 트리스 – 글리신 젤의 단백질 마커의 10 μl를로드합니다. 일부 3.1 예제의 나머지 부분을 저장합니다. ColorPlus Prestained 단백질 마커의 10μl를로드합니다. 염료 앞에는 젤 하단 때까지 실온에서 130 볼트에서 젤 Electrophorese. 젤이 실행 완료되면, 캐스트에서 젤을 제거하고 충분한 Coomasie 파란 젤을 충당하기 위해 얼룩이있는 작은 플라스틱 상자에 넣습니다. 부드러운 교반 1 시간 동안 젤 얼룩. destain 솔루션의 50 ML 30 분 동안 겔 세 번 씻으십시오. 흰색 라이트 transilluminator 또는 스캐너를 사용하여 이미지를 기록합니다. 또는 젤은 프레임에 셀로판의 시트 사이에 건조하실 수 있습니다. 3. SDS – PAGE의 젤의 glycosylated 단백질의 검출을위한 프로 Q 에메랄드 300 2.1 겔)과 병행하여, 10-20% 트리스 – 글리신 젤에있는 샘플의 나머지를로드합니다. 로드 10과 뮤; ColorPlus Prestained 단백질 마커의 리터. 젤 DMF와 프로 – Q 에메랄드 시약을 분해 및 재고 수정, 워시를 준비 실행하고 프로 – Q 에메랄드 300 솔루션을 산화하는 동안 키트와 함께 제공된 제품 설명서를 다음과 얼룩. 전기 영동이 완료되면 캐스팅에서 젤을 제거하고 플라스틱 상자에 넣습니다. 수정 솔루션 100 ML을 추가하고 부드러운 동요와 함께 실온에서 하룻밤을 떠나는하여 겔을 수정. 이방인의 교반과 함께 상온에서 10-20분에 대한 씻으 솔루션의 100 ML로 젤을 씻으십시오. 신선한 씻어 솔루션 세척을 반복합니다. 솔루션을 산화의 25 ML 30 분 부드러운 동요로 젤을 잠복기로 탄수화물을 산화. 3.5 단계에서 설명한대로 젤 씻으십시오. 젤은 25 ML 단계 3.2에서 녹아 프로 – Q 에메랄드 300 시약 용액 500 μl를 추가하여 신선한 프로 – Q 에메랄드 300 얼룩을 준비 세척하는 동안키트에 제공된 버퍼를 염색법. 3.8 단계에서 준비한 얼룩의 25 ML을 추가하고 90-120분위한 부드러운 동요와 함께 어둠 속에서 잠복기로 젤 얼룩. 3.5 단계에서 설명한 두 세척 단계를 반복합니다. 300nm에서 UV transilluminator로 이미지를 기록합니다. prestained 사다리를 보여주는 젤의 하얀 빛을 그림에 UV 이미지를 겹쳐 프로 – Q 에메랄드 그린으로 표시되는 80 kDa의 마커를 사용합니다. 3.11 단계의 프로 – Q 에메랄드 묻은 젤로 단계 2.10에서 Coomasie 스테인드 젤의 이미지를 비교합니다. 4. 대표 결과 효소 단백질 deglycosylation 후 마이 그 레이션의 변화는 그림 2에 표시됩니다. PNGase의 F 처리 (N – glycans의 제거, 차선 2), 그리고 Deglycosylation 믹스 (; 플러스 엔도와 O – glycans를 제거하는 exoglycosidases, 레인 3 PNGase F)와 (과 패널, 레인 1) 컨트롤 샘플을 비교합니다. 더 이상 감소하지크기 추가 glycosidases (레인 4) 소화 후 볼 수 있습니다. glycans가 제거 등 대량의 변경 외에도 밴드가 선명된다. 17 kDa의 마커 (별표)에서 실행 밴드는 완전히 deglycosylated hCGβ polypeptide (: 16 kDa MW)를 나타냅니다. 다른 밴드는 불완전 deglycosylation 또는 hCGβ 샘플에있는 여러 미확인 단백질 (레인 1 참조)에서 파생 수도 있습니다. 레인 5-7가 (컨트롤) glycosidases에 해당하는 밴드를 보여줍니다. 에메랄드 그린으로 당단백질의 얼룩이 시약은 단백질 분자에있는 모든 glycans를 산화 및 얼룩 패널 B.에 표시됩니다. hCGβ이 효소 (차선 4 차선 1) deglycosylated대로 따라서 신호의 강도가 줄어 듭니다. 레인 3과 4에서 잔여 신호가 사용되는 효소에 강한 glycan 모티프의 존재를 나타냅니다. 단백질 마이 그 레이션은 동일하지만 : 레인 4에 사용되는 추가 glycosidases 몇 가지 추가 설탕 잔류물을 제거얼룩의 강도에서 약간의 감소를 볼 수 있습니다. 저항 설탕 moieties은 모든 단백질 종에 존재되지 않은 몇 가지 밴드는 그들이 광범위 deglycosylated되었습니다 나타내는 에메랄드 그린 (괄호에 UV 이미지 결석)에 의해 감지되지 않았습니다. 추가 데이터 hCGβ가 glycosylated heterogeneously되는 결론을 지원합니다. 레인 2 위 밴드가 많은 glycans 그룹이 아직 존재했음을 나타냅니다 밝은 상태에서 차선 2 (화살표)에 대한 낮은 밴드는 에메랄드 그린 이미지에 희미합니다. 이 데이터는 마우스 세포에서 표현 재조합 hCGβ 여러 glycoforms에게 9에 들어있는 결론을 지원합니다. 심지어 같은 단백질에 다른 수는 없지만 이러한 다양한 glycoforms 일부 polypeptides 각 합의 사이트 및 / 또는 일부 glycans에서 glycan을받지 못한 글리코 실화의 고유 이질로 인해 아르가 연장됩니다. 그림 1.분비 또는 세포 표면 glycoproteins에 대한 일반적인 글리코 실화 패턴. hCGβ의 효소 deglycosylation을 보여주는 그림 2. SDS – PAGE의 젤. 패널 B가 glycosylated 단백질의 시각화를위한 프로 – Q 에메랄드 300의 결과를 보여주는 동안 패널 A는 Coomasie 파란 얼룩을 보여줍니다. 샘플 번호 : 1, hCGβ 제어, 2, PNGase F 소화, 3, Deglycosylation 믹스 소화, 4, Deglycosylation 믹스 플러스 exoglycosidases의 소화, 샘플 5-7이 (O – Glyc, O – Glycosidase 시약 컨트롤되며 GNA, β – N – Acetylglucosaminidase; 걸 / Fuc, β1 – 3 갈락토, α1 – 3, 6 갈락토 및 α1 – 2 Fucosidase, GalNA, α – N – Acetylglalactosaminidase, NEU, Neuraminidase, PNGase, PNGase의 F)