تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases
Summary
باستخدام glycosidases محددة لإزالة السكر من جليكوبروتينات تليها SDS – PAGE هي طريقة للكشف عن قيمة غليكان تعديلات على عينات البروتين و هو اختيار جيد للدراسات غليكوبيولوغي الأولي. ويمكن الكشف عن التغييرات التالية deglycosylation والتحولات في التنقل هلام أو تلطيخ مع الكواشف الحساسة غليكان.
Abstract
ارتباط بالغليكوزيل ، إضافة السكريات مرتبطة تساهميا ، هي كبرى بعد التعديل متعدية من البروتينات التي يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على عمليات مثل خلية التصاق ، والاتجار الجزيئية ، وإزالة الألغام ، ونقل الإشارة 1-4. في حقيقيات النوى ، والتعديلات ارتباط بالغليكوزيل الأكثر شيوعا في مسار إفرازية والاضافات في البقايا الأسباراجين الآراء (N – مرتبط) ، أو على بقايا أو السيرين ثريونين (O – مرتبط) (الشكل 1). يتم حفظها للغاية بدء N – غليكان التوليف في حقيقيات النوى ، في حين أن المنتجات النهائية يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا بين الأنواع المختلفة ، والأنسجة ، أو البروتينات. تبقى بعض glycans معدلة ("عالية مانوز N – glycans") أو يتم معالجتها مرة أخرى في غولجي ("معقدة N – glycans"). تم العثور على تنوع أكبر لO – glycans ، والتي تبدأ مع بقايا المشتركة (GalNAc) N – Acetylgalactosamine في الخلايا الحيوانية ولكنها تختلف في أقل الكائنات الحية 1.
الأنف والحنجرة "> تحليل مفصل للارتباط بالغليكوزيل من البروتينات هو حقل في حد ذاته ويتطلب موارد واسعة وخبرة لتنفيذ بشكل صحيح ، ولكن مجموعة متنوعة من الانزيمات التي تعمل على إزالة السكريات المتوفرة (glycosidases) يجعل من الممكن أن يكون فكرة عامة عن حالة من ارتباط بالغليكوزيل . بروتين في إعداد مختبر القياسية ونحن هنا توضيح استخدام glycosidases لتحليل بروتين سكري طراز : المشيمي البشري المؤتلف جونادوتروبين بيتا (hCGβ) ، الذي يحمل N – two glycans وأربعة O – 5 glycans تقنية بسيطة تتطلب فقط يمكن أن تكون الأجهزة والمواد الاستهلاكية العادية ، وأنها تتكيف بسهولة لتحليل عينات من بروتين سكري متعددة.ويمكن استخدام العديد من الانزيمات في دراسة موازية لبروتين سكري. PNGase F قادرة على إزالة ما يقرب من جميع أنواع N – مرتبطة glycans 6،7. لO – glycans ، لا يوجد أي انزيم المتاحة التي يمكن أن يلتصق an oligosaccharide سليمة من اله البروتين العمود الفقري. بدلا من ذلك ، يتم قطع O – glycans بواسطة exoglycosidases إلى نواة قصيرة ، وهو ثم إزالتها بسهولة عن طريق O – غليكوزيداز. ويحتوي على مزيج من البروتين Deglycosylation PNGase F ، O – غليكوزيداز ، النورامينيداز (سياليداز) ، غالاكتوزيداز β1 – 4 و β – N – Acetylglucosaminidase. يتم استخدامها لإزالة في وقت واحد N – glycans وبعض glycans O – 8. أخيرا ، تم استكمال ميكس Deglycosylation بمزيج من exoglycosidases الأخرى (α – N – Acetylgalactosaminidase ، α1 فوكوزيداز – 2 ، α1 – 3 ، 6 غالاكتوزيداز وغالاكتوزيداز β1 – 3) ، والتي تساعد على إزالة السكريات الأحادية التي يمكن أن تقاوم إلا أن تكون موجودة في O – glycans معينة.
يستخدم SDS-PAGE/Coomasie الزرقاء لتصور الاختلافات في بروتين الهجرة قبل وبعد العلاج غليكوزيداز. بالإضافة الى ذلك ، السكر التلوين بطريقة محددة ، ProQ الزمرد – 300 ، كما يظهر إشارة تقلص glycans هي succeإزالة ssively. ويهدف هذا البروتوكول لتحليل كميات صغيرة من بروتين سكري (0،5-2 ميكروغرام) ، رغم أنه يمكن تحجيمها deglycosylation الأنزيمية لاستيعاب كميات أكبر من البروتين حسب الحاجة.
Protocol
Discussion
وصف الأسلوب هنا باستخدام deglycosylation الأنزيمية وSDS PAGE ، يمكن أن توفر معلومات قيمة حول حالة ارتباط بالغليكوزيل من البروتين من الفائدة ، بينما غليكان محددة الكواشف تسهيل تفسير البيانات. ويهدف هذا البروتوكول للدراسات الأولية للارتباط بالغليكوزيل البروتين وخصوصا انه يناسب لإفرازية وجليكوبروتينات الغشاء من خلايا الثدييات : الانزيمات المختار في هذه الحالة على وجه التحديد سوف يزيل جميع N – glycans وأو N – glycans زائد والسكريات الأكثر شيوعا توسيع وتشكيل نواة O – glycans. Glycosidases لديها ميزة إضافية كونها معتدلة ، مقارنة مع أساليب deglycosylation الكيميائية ، والحفاظ على سلامة كل من السكريات والبروتين العمود الفقري.
لتوضيح معدل الإشغال (التي هي الغليكوزيلاتي الأحماض الأمينية) ، ومدى ارتباط بالغليكوزيل ، أو لتحديد هيكل غرامة glycans ، وتقنيات أكثر تطورا مثل ممطلوبة الطيف الحمار ، واللوني السائل أو الرنين المغناطيسي النووي.
بسبب بساطتها ، يمكن تعديلها عدة خطوات في هذا البروتوكول ، واستبداله ، و / أو مجتمعة لتلبية احتياجات مختلف التجريبية. ومع ذلك ، من أجل الحصول على النتائج التي يمكن أن تفسر بشكل واضح أنه من المهم أن نفهم نقاط قوتها والقيود. أولا ، لخصوصية ونقاء glycosidases حاسمة : يجب ان تستخدم فقط الانزيمات جيدا اتسم اختبارها لتكون خالية من البروتياز وغيرها من الأنشطة الملوثة. للأسف ، لا توجد وحدة انزيم تعريف موحد للglycosidases ؛ يجب على المستخدم تحديد بدائل مناسبة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. الثاني ، وهو اختيار دقيق للكشف ضروري : أ تلطيخ بروتين) الكواشف مفيدة فقط إذا deglycosylation في النتائج تحولا كبيرا في الكتلة الجزيئية. ليست هذه نتيجة واضحة كما هو موضح هنا تم الحصول عليها دائما. في حالات أخرى ، شهدنا ميل طبيعيغريشن بعد deglycosylation (بعيدا عن الوزن الجزيئي وتوقع ، أو حتى الهجرة أبطأ). ليست هذه الظاهرة مفهومة جيدا ، ولكن يمكن القول أن أي تغيير في الهجرة هي الأدلة التي تم deglycosylated البروتين. ب) الكشف عن الأجسام المضادة للسكر مع تحديات فريدة الحد من تطبيقها. فقد كان من الصعب للغاية لتوليد العامة لمكافحة غليكان الأضداد ؛ تثار عادة ضد هدف غليكان المعقدة ، الأمر الذي يحد من استخدامها. وعلاوة على ذلك ، وعدة وحيدة النسيلة المضادة للأضداد غليكان عرض تفاعلية عبر 10 غير مرغوب فيها. ج) Lectins (البروتينات مع تقارب السكر الذاتية) هي مناسبة تماما للكشف عن السكر ، بالإضافة إلى أنها تعطي فكرة عن هيكل غليكان. ومع ذلك ، ليس كل منهم يملك خصوصية ضيقة ، وتتميز العديد جزئيا فقط (بمعنى أنها يمكن أن تكون الصلات غير معروف). باعتباره نتيجة تلطيخ lectin مؤشرا إيجابيا ، وليس دليلا ، من وجود غيفين السكر. د وضع العلامات الكيميائية) مجموعات (على أساس الأكسدة بريودات من السكريات) هي الطريقة المفضلة لصبغ جميع جليكوبروتينات ، وبالتالي تتناسب بشكل جيد لمتابعة deglycosylation.
عند معالجة عينة مجهولة ، وهو ممارسة جيدة لتشمل الضوابط بروتين سكري. فتوين هي متاحة بسهولة N — O وبروتين سكري ؛ موجهة الغدد التناسلية المشيمية (سواء مفارز) هو أيضا خيارا جيدا. ألبومين المصل البقري يمكن (BSA) أن يستخدم كعنصر تحكم سلبية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن بعض البروتينات غير الغليكوزيلاتي يتفاعل بشكل طفيف مع الزمرد الموالية للس 300 ، وخاصة عندما تستخدم في تركيزات عالية. غير الغليكوزيلاتي معايير الوزن الجزيئي ، مثل علامة البروتين prestained المستخدمة في هذا البروتوكول ، لديها ميزة عرض شرائح حادة. فقط عن طريق الصدفة هي واحدة من هذه البروتينات (80 كيلو دالتون) رد الفعل المؤيدة للالزمرد س 300. لذا ، قد يكون للمستخدم تريد تشغيل سلم القياسية بدلا من بروتين سكري ، مثل حلوى قصب من Invitrogeن.
أخيرا ، بسيطة في جل كشف جليكوبروتينات nucleocytosolic (والتي يتم تعديلها مع GlcNAc – O واحد) هو ممكن مع استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، جنبا إلى جنب β – N – Acetylglucosaminidase من أجل السيطرة النوعية 11. وصف هذا الأسلوب هو ما وراء وتجدر الإشارة نطاق هذه المقالة ، ولكنه كما glycosidases هي أدوات مفيدة لدراسة جليكوبروتينات أخرى كثيرة ، وglycoconjugates موجودة في الخلايا. يمكن العثور على العلاج الشامل لجميع أشكال معروفة من ارتباط بالغليكوزيل في الطبعة الثانية من "أساسيات غليكوبيولوغي" ؛ عبر الإنترنت الحرة المتوفرة على رف الكتب NCBI (ID BOOKSHELF : NBK1908 ؛ PMID : 20301239) 12.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
دون مشط
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Human chorionic gonadotropin β | Sigma Aldrich | C6572 | |
| PCR Tubes | VWR | 20170-004 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
| Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
| α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
| α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
| α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
| β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
| 10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 10% NP-40 | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
| ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
| 10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
| Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
| Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
| Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
| Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |
References
- Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease. Cell. 126, 855-867 (2006).
- Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins. Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).
- Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function. Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).
- Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit. Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).
- Tarentino, A. L., Plummer, T. H. Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).
- Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. Novel endo-α-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity. Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).
- Thakur, D. Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).
- Park, S., Lee, M. R., Shin, I. Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes. Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).
- Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine. Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).
- Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2008).
