Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

1. Cell Culture, virale Transduktion, und Protein Expression Kultur mit hoher Dichte hippocampalen Neuronen aus embryonalen Tag 18 (E18) Rattenbabys auf Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser für 14-25 Tage in vitro (DIV). 6-24 Std. vor der Live-Experimente, transduzieren Zellen mit verminderter Sindbis-Virus enthält, der das Membranprotein von Interesse, mit dem Super-Ekliptik im Gegensatz zu GFP (SEP) markiert. In den Pseudovirion-Medium direkt auf das Deckglas mit 1 ml konditioniertes Medium und wieder in den Inkubator. Der Titer und die Zeit für die Proteinexpression nach virale Transduktion wird abhängig von der Charge-Virus und sollte für jede Charge vor Beginn lebenden Zellen ermittelt werden. 2. FRAP-FLIP Live Cell Imaging Gerätesatz-up Übertragen Sie das Deckglas auf dem Imaging-Kammer eines Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokalen Mikroskop.Um Leistungsschwankungen während der Bilderzeugung zu minimieren, sicherzustellen, das Mikroskop eingeschaltet ist, mit 100% Laserleistung, für mindestens 20 Minuten vor der Bebilderung. Unmittelbar, ersetzen Sie das Kulturmedium mit vorgewärmten (37 ° C) Aufnahme extrazellulären Lösung mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM Glucose, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mM HEPES (pH eingestellt 7,4 mit NaOH) und platzieren Sie die Kammer auf der vorgewärmten Bühne (37 ° C) des Zeiss Axiovert. Stellen Sie sicher, die Osmolarität der extrazellulären Recording-Lösung, um innerhalb von 10 mOsM Ihrer Kulturmedium eingestellt. Keine wesentliche Verdampfung auftritt während der Zeitverlauf des Experiments, aber dieses CO 2-unabhängige Lösung für kurze Experimente (<10 stunden). die ergänzung mit 1-2 mm natriumbicarbonat wird empfohlen. definition der parameter image capturing zuerst ermitteln ein neuron expression des rekombinanten proprotein von interesse und bringen sie in den fokus. einem 63x Öl widersprochen, erwerben bild gesamten zelle 488nm laserlicht anregung bei geringer laserleistung. zur minimierung ausbleichen, verwenden einen schnellen nenndrehzahl (7-9) geringen pixel-auflösung (512 bis 512) halten insgesamt scan-geschwindigkeit <1 sekunde. wählen teil dendriten zu zoom, um rahmen dem roi (~ 1,5 2,5 x optischen zoom) erfassen. wo möglich, sicherzustellen, das gesichtsfeld enthält mehrere prozesse, so dass messungen referenz-dendriten erhalten werden kann, festzustellen, ob nicht-spezifische photobleichen aus erwerb auftritt. veränderung filter aus, pinhole, und-verstärkung, maximale fluoreszenz minimal laseranregung aber begrenzter sättigung ermöglichen. großer durchmesser blende empfohlen, photon sammlung maximieren (2 &mgr; m eignet sich für stacheln ternären dendriten). detektor gain sollte stark genug sein, kleinen schritten erkennen,derart, allerersten bilder, vor ausbleichen nicht überwunden 10% gesättigten pixel. speichern diese konfiguration, pre-> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Prinzipien der FRAP vs FRAP-FLIP-Protokolle Dieses Diagramm veranschaulicht die Ergebnisse einer regelmäßigen FRAP im Vergleich zu einem 'FRAP-Flip' Protokoll, mit SEP-markierten Rezeptoren. Fluorescence Recovery in traditionellen FRAP ist auf der linken Seite gezeigt. Gemessen Fluoreszenzerholung im zentralen ROI ist eine Kombination der lateralen Diffusion f nicht photogebleicht SEP-markierten Rezeptoren von außerhalb der ROI photogebleicht und Einsetzen von Rezeptoren durch Recycling und / oder De-novo-Exozytose in die dendritische Welle zurückzuführen. Dagegen ist die sich wiederholende photogebleicht der flankierenden ROIs in der rechten Seite dargestellt ist, zeigt, wie diesem modifizierten "FRAP-Flip 'Protokoll Schweigen Erholung durch laterale Diffusion. Als solches kann jede gemessene Fluoreszenz wieder auf direkte Insertion in der ROI zurückgeführt werden. Abbildung 2.Einfügen von SEP-GluA2 in die Plasmamembran auf der dendritischen Welle A) Eine Hippocampus exprimiert SEP-GluA2, selektiv entlang eines Bereichs von Dendriten gebleicht. Die Darstellung zeigt die Region von Dendriten, die abgebildet wurde, während der obere linke Panel unterstreicht die ROIs, die für Photobleaching ausgewählt wurden. Das große weiße Box-Gebiet wurde einst, gebleicht, gefolgt von sich wiederholenden Bleichen der flankierenden boxed Regionen, mit Doppelkopf blauen Pfeilen markiert. Diese Tafel zeigt die Dendriten vor Ausbleichen. Der rote Pfeil zeigt die gemessene ROI, in starker Vergrößerung in den unteren Platten gezeigt. B) zeigt die Fluoreszenzintensität in der gemessenen ROI über den Zeitverlauf des Experiments, dargestellt als Graupegel in dem ROI (nicht normalisiert). Der schwarze Pfeil markieren Sie den Zeitpunkt der ursprünglichen Photobleichmittels und grüne Pfeil zeigt den Beginn der repetitiven Ausbleichen. &Dgr; Zeigt the Anstieg der Fluoreszenz über der Erholungsphase beobachtet werden, durch Einsetzen der September-GluA2 in den dendritischen Schaft. Nachfolgende niedrigen pH-Wert und pH 7,4 + NH 4 Cl Wäschen bestätigen, dass die Fluoreszenz wieder zu exprimierten Rezeptoren Oberfläche bezieht. Abbildung 3. Recycling & laterale Diffusion vs Recycling von SEP-GluK2 auf der dendritischen Schaft nach Cyclohexamid Behandlung A) Ein Hippocampus ausdrückt SEP-GluK2, selektiv photogebleicht mit parallelen FRAP und 'FRAP-FLIP "Verwertung Protokolle entlang getrennten dendritischen ROIs durchgeführt. Dieses Neuron war Gegenstand einer Vorbehandlung mit Cycloheximid, um die Proteinsynthese (2 Stunden bei 200 ug / ml) zu blockieren. Die Darstellung zeigt die Region von Dendriten, die abgebildet wurde, während die linke Hand Panel Hervorhebung der ROIs, die für Photobleaching ausgewählt wurden. The große weiße Box-Gebiet wurde einst, gebleicht, gefolgt von sich wiederholenden Bleichen der flankierenden Regionen boxed, der unteren Dendriten nur mit zwei Spitzen blauen Pfeilen markiert. Diese Tafel zeigt die Dendriten vor dem Ausbleichen. Rote Pfeile markieren die ROIs in hoher Vergrößerung in B gezeigt), welche die Fluoreszenz Erholung im traditionellen FRAP gegenüber dem 'FRAP-Flip' Protokoll. Ein Vergleich der Werte der Fluoreszenzintensität in der späten Phase der Rückgewinnung (dritte Feld) für den Beitrag der lateralen Diffusion und Recycling gegenüber Recycling allein. C) zeigt die Fluoreszenzintensität in der gemessenen ROIs über den Zeitverlauf des Experiments, dargestellt als normierte Intensität Werte. Der schwarze Pfeil markieren Sie den Zeitpunkt der ursprünglichen Photobleichmittels und grüne Pfeil zeigt den Beginn der repetitiven Ausbleichen. &Dgr; Rec zeigt den Einschwingvorgang durch Rezeptor-Recycling, von der FRAP / FLIP Dendriten bestimmt, während &Dgr;Unterschied wird der Beitrag des lateralen Diffusion von SEP-GluK2 in den dendritischen Welle in der "FRAP nur 'Return on Investment. Die vorübergehende Erhöhung wird durch allmählichen Rückgang der Signal entsprechend dem Herunterfahren der verfügbaren Rezeptoren durch Cycloheximid-Behandlung. Die anschließende niedrigen pH-Wert und pH 7,4 + NH 4 Cl Wäschen bestätigen, dass die Fluoreszenz wieder zu exprimierten Rezeptoren Oberfläche bezieht.