Nylige fremskritt innen to-foton mikroskopi har aktivert sanntid<em> I</em> Situ avbildning av levende vev i dyremodeller, og dermed styrke vår evne til å undersøke cellulære oppførsel i både fysiologisk og patologisk forhold. Her skisserer vi forberedelsene som kreves for å utføre intravital avbildning av musen popliteal lymfeknute.
Lymfeknuter (LNS) er sekundære lymfoide organer, som er strategisk plassert over hele kroppen for å tillate fangst og presentasjon av utenlandske antigener fra perifert vev til prime den adaptive immunresponsen. Sidestilt mellom medfødte og ervervede immunresponser, er det LN et ideelt sted å studere immunceller interaksjoner 1,2. Lymfocytter (T-celler, B-celler og NK-celler), dendrittiske celler (DCS), og makrofager utgjør hoveddelen av benmarg-avledet cellulære elementer av LN. Disse cellene er strategisk plassert i LN for å tillate effektiv overvåking av selvtillit antigener og potensielle utenlandske antigener 3-5. Den prosessen som lymfocytter vellykket møte beslektet antigener er en gjenstand for intens etterforskning i de senere årene, og innebærer en integrasjon av molekylære kontakter, inkludert antigen reseptorer, adhesjonsmolekyler chemokines og stromale strukturer som fibro-retikulære nettverk 2,6-12 . </p>
Før utviklingen av høyoppløste sanntid fluorescerende in vivo imaging, etterforskere støttet seg på statiske bilder, som bare gir svar om morfologi, plassering og arkitektur. Selv om disse spørsmålene er grunnleggende i vår forståelse av immun celle atferd, ikke begrensningene iboende med denne teknikken ikke tillater analyse for å dechiffrere lymfocytt menneskehandel og miljømessige ledetråder som påvirker dynamisk celle atferd. Nylig har utviklingen av intravital to-foton laser scanning mikroskopi (2P-LSM) har gjort etterforskere for å vise dynamiske bevegelser og vekselvirkninger enkelte celler i løpet av live LNS in situ 12-16. Spesielt har vi og andre brukt denne teknikken til bildet mobilnettet atferd og interaksjoner innen popliteal LN, hvor den kompakte, tette naturen byr på fordelen av multipleks datainnsamling over et stort vev område med ulike vev sub-strukturer 11,17-18 . Det jeger viktig å merke seg at denne teknikken gir ekstra fordeler over eksplanterte vev imaging teknikker som krever forstyrrelser av blod, lymfe flyt, og til slutt de cellulære dynamikken i systemet. I tillegg eksplanterte vev har en svært begrenset tidsvindu der vev forblir levedyktig for avbildning etter eksplantering. Med riktig fuktighet og overvåking av dyrets miljøforhold, kan bildebehandling tid bli betydelig lengre med denne intravital teknikken. Her presenterer vi en detaljert metode for å forberede mus popliteal LN for utøvelse av intravital bildebehandling.
Nylige fremskritt i høy oppløsning i situ imaging teknikker, særlig 2P-LSM, har blitt ledsaget av en økende interesse for studiet av dynamiske mobilnettet oppførsel in vivo. Den 4D avbildningsteknikk på popliteal LN av en live mus tillater slike analyser i den dynamiske oppførselen til immunceller innenfor uforstyrret vev mikro-miljø. Bruken av 2P-LSM med flere detektorer som dekker hele synlige spekteret tillater simultan avbildning datainnsamling av flere celle populasjoner. Dette kan nå oppnås gjennom bruk av in vivo celle-spesifikke fluorescerende reporter mus (f.eks ubiquitin-eGFP,-RFP eller-eCFP) kombinert med bruk av adoptive overføring av differensielt merket celle populasjoner ved bruk av organiske fluorescerende fargestoffer celle (f.eks CFSE , SNARF-1, og Cell Tracker Orange) for å undersøke cellulære mekanismer og funksjon i LN. I tillegg til direkte observasjon av samspill mellom ulikt spores cell populasjoner, kan multipleks tenkelig datasett gjennomgå ytterligere analyse med kommersielt tilgjengelige bildebehandlingsmotoren programmer (f.eks Imaris, BitPlane Inc.) til ytterligere belyser celle atferd og funksjon. Et bredt spekter av muligheter som finnes for å studere cellulære mekanismer samhandling med disse in vivo og i silico teknikker.
Den viktigste begrensningen av eksperimentell tilnærming som beskrives her er den tekniske kompleksiteten som ligger i kirurgi tilnærming. Denne teknikken krever hardtrening for å bli kjent med relevant anatomi og de presise tekniske prosedyrer og ferdigheter som kreves av denne protokollen. Ytterligere kompliserende faktorer er vanskeligheten i å minimere vevskade under LN leting, optimalisere vev stabilitet under bildebehandling, og hindre termisk og laser skade på LN før og under bildebehandling eksperimentering. Perturbasjon til noen av disse faktorene vil føre til mindre enn optimal lymfeocyte motilitet og vil derfor forstyrre riktig tolkning av resulterende imaging dataanalyser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra 1R01CA154656 NCI, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick stiftelse, Dana Foundation, Gabrielle s Angel Foundation, og Hyundai Motors of America "Hope-on-Wheels" Program.
Reagent | Company | Catalogue Number |
Isoflurane, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-773-60 |
Vetbond | 3M | 1469SB |
Nair – hair removal lotion | Nair | |
PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV |
Heating pad | Watlow | |
Heating Pad Controller | Watlow | |
Air and O2 | Airgas | |
Temperature probe | Harvard Apparatus | |
Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc | 14101 |
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc | 14141 |
Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5880 |
Cover of 100×20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 |
Cover of 100×20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 |
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-150-08 |