Beoordeling van de GFP expressie en levensvatbaarheid Met behulp van de Tali Image-Based Cytometer
Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe u levensvatbaarheid van de cellen en de fluorescentie expressie assays met behulp van de Tali Image-Based Cytometer.
Abstract
Single-cell en de bevolking informatie worden over het algemeen ofwel verkregen door flowcytometrie of fluorescentie microscopie. Echter, deze twee methoden bieden verschillende informatie. Flowcytometrie geeft kwantitatieve multi-parametrische informatie over de fysieke kenmerken en vlekken of expressie, maar niet mogelijk voor visualisatie. Stand-alone fluorescentie microscopie biedt visuele gegevens, maar niet mogelijk voor eenvoudige kwantitatieve metingen 1.
Image-gebaseerde cytometrie overbrugt de kloof tussen deze twee methoden, waardoor de snelle visualisatie en gelijktijdige kwantitatieve analyse van duizenden cellen in heterogene populaties 2. Hier presenteren we een methode voor het uitvoeren van levensvatbaarheid van de cellen en de green fluorescent protein (GFP) expressie assays met behulp van de Tali Image-Based Cytometer 3. De Tali instrument is een 3-kanaals (helderveld, groene fluorescentie, rode fluorescentie) stationaire test platform dat biers een aantal voordelen ten opzichte van flowcytometrie en fluorescentie microscopie. De Tali cytometer is minder duur, neemt minder ruimte in de zuurkast, vereist minder onderhoud, en de workflow is vereenvoudigd, zodat de operatie en analyse is veel eenvoudiger en sneller. De Tali cytometer is in staat om een reeks van opschorting cel-gebaseerde testen, met inbegrip van GFP en rode fluorescente eiwit (RFP) expressie, apoptose 4-6 en levensvatbaarheid van de cellen analyse met propidiumjodide (PI) 7-11.
Hier laten we zien van het gebruik van de Tali instrument in het uitvoeren van een test levensvatbaarheid van de cellen in cellen die GFP. GFP-getransduceerde cellen worden gekleurd met behulp van de Tali Levensvatbaarheid Kit – Dead Cell Red. De cellen worden vervolgens gepipetteerd in een Tali Cellular Analyse Schuif en geladen in de cytometer. Helderveld, rode fluorescentie en groene fluorescentie beelden worden vastgelegd en geanalyseerd met behulp van test specifieke algoritmen. Histogrammen worden dan gegenereerd om celgrootte, PI fluo weer te gevenrescence intensiteit en GFP fluorescentie-intensiteit. Deze parameters kunnen vervolgens worden thresholded naar huis in op een specifieke cel populatie.
Een side-by-side vergelijking van de Tali Image-Based Cytometer en traditionele flowcytometrie toont aan dat de twee methodes vergelijkbare gegevens over levensvatbaarheid van de cellen en eiwit expressie te geven. Echter, de Tali instrument biedt extra visuele informatie over de cel bevolking dat niet kan worden verkregen met behulp van een flowcytometer.
Protocol
Discussion
We hebben net een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van levensvatbaarheid telt en het beoordelen van GFP expressie met behulp van de Tali Image-Based Cytometer. Volgens dezelfde procedure, is dit cytometer is in staat om een aantal andere testen, waaronder: apoptose, RFP en de levensvatbaarheid van de cellen analyse met behulp van niet-getransduceerde cellen.
Fluorometrische testen van de levensvatbaarheid van de cel, genexpressie en apoptose zijn belangrijke methodieken in biomedisch onderzoek 7-12. In het verleden aparte instrumentatie is gebruikt om kwantitatieve en visuele informatie over de cellen te verkrijgen. Terwijl de kwantitatieve informatie over de cellen binnen een heterogene populatie is vergaard door het gebruik van flowcytometrie, is visuele of kwalitatieve informatie is verzameld door het gebruik van fluorescentie microscopie 1-4. Hier presenteren we een technologie die de kloof tussen bevolking en de individuele cel studies bruggen. Met behulp van de Tali Image-Based Cytometer, kwantitatieve data en visuele cel gegevens over individuele cellen of celpopulaties kunnen gelijktijdig worden verzameld. De Tali instrument kan worden gebruikt voor een scala van toepassingen, waaronder de beoordeling van de genexpressie, apoptose assays, studies van geneesmiddelen de werkzaamheid en de beoordeling van de progressie van de ziekte.
De Tali Image-Based Cytometer opvangt en analyseert bright-field, rode fluorescentie en groene fluorescentie beelden, zodat informatie over subpopulaties van cellen te verkrijgen. Bijvoorbeeld, in deze test waren we in staat om dode cellen te onderscheiden van levende cellen in het GFP-expressie celpopulatie met behulp van Dead Cell rode kleurstof. Dit geeft de nauwkeurigheid bij het meten van levensvatbare cellen die GFP, en identificeert de populatie van cellen bruikbaar is voor verdere verwerking. Het is belangrijk op te merken dat de dode cellen in de bevolking zou kunnen ontstaan uit verschillende bronnen, waaronder de normale celdood in cultuur of celdood veroorzaakt door omgevingsfactoren (zoals trypsinebehandeling of death geïnduceerd door de gekozen transfectie / transductie-methode).
Hier laten we zien het gebruik van de Tali cytometer met U2OS cellen. Gelijkaardige methodes kan worden uitgevoerd met de meeste zoogdieren en insecten cellen. Voor elke cellijn, de Tali cytometer geproduceerd kwantitatieve GFP-expressie gegevens, die niet mogelijk is met een visuele inspectie van de cellen met behulp van een standaard fluorescentie microscoop. Hoewel deze resultaten zijn vergelijkbaar met flow cytometrie, worden ze verzameld in een fractie van de tijd. De cytometer is in staat om nauwkeurig tellen van cellen tussen de 5 micrometer tot 60 micrometer in diameter, idealiter op een concentratie van 1 x 10 5 tot 1 x 10 7 cellen / ml.
Het is belangrijk erop te wijzen dat de meeste standaard vlekken protocollen, waaronder de Dode Cell Red kleuringsprotocol hier beschreven, gebruik propidiumjodide om te wonen en dode cellen te onderscheiden. Dit betekent een uitdaging bij de beoordeling van de levensvatbaarheid in cellen die zijn gepermeabiliseerde voor staining van intracellulaire markers, aangezien PI zal elke cel vlek met een gecompromitteerd membraan. Aangezien elke fluorescerende kleurstof of eiwit dat kan worden gedetecteerd met de groene of rode fluorescentie-kanalen kunnen worden geanalyseerd op de Tali Image-Based Cytometer, kunnen toekomstige studies onderzoeken het gebruik van alternatieve kleurstoffen, zoals amine reactieve levensvatbaarheid kleurstoffen 4. Een studie uit 2006 door Perfetto et al.. 12 gevonden van deze kleurstoffen aan eenvoudig te gebruiken en reproduceerbaar zijn discriminerend levende en dode celpopulaties.
Merk op dat de Tali beperkingen heeft met betrekking tot de aard van de testen kan uitvoeren. Bijvoorbeeld, aangezien de doelstelling die door het instrument is 4X, tellen tijdelijke acties om grotere soorten cellen: sub-cellulaire structuren zoals mitochondriën of blaasjes, en bacteriële cellen kunnen niet worden gekwantificeerd. Merk ook op dat de detectie kanalen in Tali zijn beperkt tot fluoroforen dat zal prikkelen en uit te stoten in de kanalen. Terwijl YFP en helder mCherry signalen ceen worden gedetecteerd, dimmer mCherry signalen kunnen niet. Ten slotte is de Tali analyses enige cellen in suspensie. Het zal niet nauwkeurig te tellen cellen vast te houden aan een dia. Bovendien, terwijl er slechts beperkte mogelijkheden voor het tellen van cellen die onregelmatig worden gevormd, waaronder enkele gist en primaire cellen.
Daarnaast zullen toekomstige studies waarschijnlijk het adres van het gebruik van dit systeem bij de beoordeling van de expressie van intracellulaire markers. Individuele kleurstoffen kan worden gecontroleerd spectrale overlap met aangrenzende kanalen, het gebruik van online SpectraViewer Invitrogen's tool ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). Gezien de nieuwheid van deze technologie, het volledige scala van toepassingen moet nog worden ontdekt.
Kortom, de Tali Image-Based Cytometer toonde hier presenteert een nieuwe technologie die het mogelijk maakt voor gelijktijdige visualisatie en analyse van celpopulaties, zodat de beoordeling van individuele cellen en cell populaties in een compact formaat met een eenvoudige workflow.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 |
| U2OS cells |
References
- Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy. Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).
- Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry. Scanning. 33, 33-40 (2011).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-654 (2002).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Koopman, G. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84, 1415-1420 (1994).
- Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests. J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).
- Jones, K. H., Kniss, D. A. Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture. J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).
- Dell’Arciprete, R. High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).
- Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
