에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em> VIVO에서</em> Electroporation
Summary
마우스 내이 (内耳)는 누구의 발달 프로그램의 회임 기간 동안 정교하고 있습니다 placode 파생 감각 기관이다. 우리를 정의<em> utero에서</em세 단계로 구성된> 유전자 전달 기술 : 마우스 복부 개복술, transuterine microinjection, 그리고<em> 생체내에서</em> electroporation. 우리는 중요한 실험 embryological 기술을 입증하는 디지털 비디오 현미경을 사용합니다.
Abstract
; utricle 및 saccule의 maculae 및 코일 달팽이관에 Corti의 기관 반원의 운하 ampullae 3 cristae : 포유류의 내이 (内耳)는 6 독특한 감각 상피 조직이 있습니다. cristae와 maculae은 Corti의 기관에서 청각 세포가 1 청각의 기본 트랜스 듀서 반면 기계적 자극이 균형의 특별한 감각을 보조하다 할 transduce vestibular 세포가 포함되어 있습니다. 반원의 운하와 달팽이관 이러한 감각 상피 조직과 morphogenesis의 세포 운명 사양은 마우스의 태동의 두 번째 주 동안 자리를 대신하고 대부분이 출산 2,3 전에 완료됩니다. 마우스 내이 (内耳)의 발달 연구는 정기적으로 세포 및 / 또는 형태학의 phenotypes 4,5의 분자 기초에 대한 통찰력을 얻기 위해 다른 배아 또는 출생 후의 단계에서 유전자 변형 배아를 수확하여 실시하고 있습니다. 우리는 utero의 발전 마우스 내이 (内耳)에 해당 유전자 전달 가설 </ em>는 이득과 손실의 기능 연구의 맥락에서 포유류의 내이 (内耳)의 개발 6 밑에있는 유전자 메커니즘의 심문에 대한 전통적인 마우스 transgenesis에 대한 무료 접근 방식을 나타냅니다.
복부 개복술 1), 2) transuterine microinjection 및 생체내의 electroporation 3) : 개발 마우스 내이 (内耳)에 유전자 misexpression 연구를 실시하는 실험적 패러다임 여기서 보여주 세 일반적인 단계로 해결됩니다. 복부 개복술은 이식 배아 7 실험적 액세스할 자궁 externalization를 허용 마우스 생존 수술 기법입니다. Transuterine microinjection은 귀의 소포 또는 otocyst의 루멘에 플라스미드 표현을 소개 beveled, 유리 모세관 micropipettes의 사용이다. 생체내에 electroporation은 전구 세포의 8-10로 플라스미드 표현을 운전 사각 파, 직류 펄스의 응용 프로그램입니다.
<p cl엉덩이 = "jove_content"> 우리는 이전에이 electroporation 기반 유전자 전달 기술을 설명하고 프로토콜 11의 각 단계에 대한 상세한 기록이 포함되어 있습니다. 마우스 실험 embryological 기술은 산문에서 배우고 스틸 이미지 혼자하기 어려울 수 있습니다. 현재 직장에서 우리는 유전자 전달 절차의 3 단계를 보여줍니다. 대부분 비판적으로, 우리는 방법 정확하게 표시하는 디지털 비디오 현미경을 배포 : 1) utero에서 배아 방향을 파악, 2) otocyst에 주사를 타겟팅을위한 배아를 방향, 3) 배아 일 11.5에서 otocyst로 추적 염료 용액과 혼합 DNA를 microinject과 12.5, 출생에서 출생 후의 선택과 5) 라벨 electroporated 배아, 4) 주입 otocyst을 electroporate. 일반적인 방법론적인 오류를 방지하는 방법을 논의; otocyst mistargeting의 가장 일반적인 원인에 그림 가이드, 우리는 성공적으로 transfected 안쪽 귀의 대표적인 예제를 제공하고 utero g에 쓰기 위해 현재 지침에너지 전송 동물 케어 프로토콜.Protocol
Discussion
개발 마우스 내이 (内耳)에 유전자 이체 : 마우스 내이 (内耳)는 postimplantation 개발 12,13의 첫 주 동안 귀의 placode에서 개발하고 있습니다. 배아 일 9.5 (E9.5)으로 placode는 invaginated했으며 otocyst 2라는 액체가 채워진 소포로 morphed. 소포에 귀의 엽 성의 전구 물질이 성숙한 내이 내의 감각과 nonsensory 세포뿐만 아니라 vestibular과 청각 감각 상피 조직에 기계적으로 민감한 세포?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원래 참조 11 페이지 130에 출연 microinjection의 피펫 제조 수치를 게시할 수있는 권한에 대한 Humana 보도 감사, videography에 대한 래리 Dlugas와 스티븐 왕, 교육 통신 OHSU학과, 영상 디자인 및 편집 래리 Dlugas; 아담 M. O '퀸, 수석 디자이너, 기술적인 설계도를 제공하기 위해 우리의 정의 수평 층류 후드와 레 금세 공인을 디자인 Trion / Envirco, 빅터 Monterroso, 뮤직 비디오, 석사, 박사와 톰 Chatkupt, DVM, 비교 의학 OHSU학과,지도에 대한 우리 함께 동물 보호 프로토콜, 수술 기법 및 예방 진통제 처방, 마르셀 Perret-Gentil, DVM, MS, 수의학 suturing 기법에 그의 유인물을 공유하기위한, 우리의 어도비 프리미어 프로 영상 현미경 컴퓨터 워크 스테이션을 설계 에드워드 Porsov, 석사, 그리고 레아 공주와 LNS의 요나 Hinckley은 (포틀랜드 오레곤) 자막. 이 작품은 난청과 othe에있는 국립 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다R 통신 장애 : DC R01 008595 및 DC R01 008595-04S2 (JB까지)와 P30 DC005983 (오레곤 청각 연구 센터 코어 그랜트, 피터 길레스피, 교장 탐정).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | Becton Dickison | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. . Principles of Veterinary Suturing. , .
- Oesterle, A. . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2011).
