Summary

Semplice e robusta In vivo E In vitro per lo Studio Assemblea Virus

Published: March 01, 2012
doi:

Summary

Un modo semplice, efficace e robusto per sincronizzare l'erogazione di più componenti virali di cellule vegetali tramite<em> Agrobacterium</em>-Mediata espressione transiente è descritto. Questo approccio è suscettibile per studiare la replicazione, seguita da incapsidamento<em> In vitro</em> Riassemblaggio di non virali componenti nel genoma impoverito ottici fantasmi virali adatti per applicazioni biomediche.

Abstract

In positivo-virus con RNA genomi senso patogeno per gli esseri umani, animali e piante, incapsidazione progenie in virioni maturi e stabili è una fase cardinale durante la creazione di infezione in un determinato host. Di conseguenza, lo studio delle incapsidazione decifra le informazioni riguardanti il ​​know-how del meccanismo di regolazione di assemblaggio del virus per formare virioni infettivi. Tale informazione è di vitale importanza nella formulazione di nuovi metodi di arginare diffusione del virus e il controllo delle malattie. Incapsidamento Virus possono essere studiati in vivo e in vitro. Incapsidazione Genoma in vivo è un processo altamente regolato selettiva che le interazioni macromolecolari e compartimentazione subcellulare. Pertanto, lo studio porta a sezionare gli eventi che comprendono incapsidazione virus in vivo avrebbe fornito le conoscenze di base per comprendere come i virus proliferano e assemblare. Recentemente incapsidazione in vitro è stata sfruttata per la ricerca nel campo della biomedica imaging e applicazioni terapeutiche. Non capsulati virus delle piante stanno molto più avanti nella joint venture di incapsidazione in vitro del materiale caricato negativamente straniera. Virus del mosaico Brome (BMV), privi di involucro multicomponente RNA virus patogeno per le piante, è stato utilizzato come sistema modello per lo studio confezionamento genoma in vivo e in vitro. Per i saggi di incapsidamento in Nicotiana benthamiana, mediata da Agrobacterium espressione transiente, si riferiscono come agroinfiltration, è una tecnica efficiente e robusto per la consegna sincronizzata e l'espressione di più componenti alla stessa cella. In questo approccio, una sospensione di cellule di Agrobacterium tumefaciens che trasportano binari vettori plasmidici che trasportano cDNA di mRNA desiredviral è infiltrata nella foglia spazio intercellulare withina utilizzando niente di più sofisticato di una siringa monouso da 1 ml (senza ago). Questo processo determina il trasferimento di inserto di DNA nelle cellule vegetali, il T-DNAInserto rimane transitoriamente nel nucleo e viene quindi trascritto dall'host polimerasi II, con conseguente espressione transiente. La trascrizione mRNA risultante (livellata e poliadenilato) viene poi esportato nel citoplasma per la traduzione. Dopo circa 24 a 48 ore di incubazione, sezioni di foglie infiltrati possono essere prelevati per le analisi biochimiche microscopyor. Agroinfiltration permette grandi numeri (centinaia di migliaia) di cellule trasfettate da simultaneamente. Per incapsidazione in vitro, virioni purificati di BMV sono dissociate in proteina del capside di dialisi contro tampone di cloruro di calcio dissociazione contenente seguita dalla rimozione di RNA e non-virioni dissociate mediante centrifugazione. Genome subunità proteiche del capside impoverito vengono poi riassemblati con desiderati componenti del genoma virale o non virale componenti come indocianina colorante.

Protocol

1. Materiale vegetale Nicotiana benthamiana da utilizzare nel saggio incapsidamento dovrebbe essere a 4 fase foglie (piante settimane circa 3-4 anni). 2. La consegna e l'espressione di componenti funzionali del genoma virale di piantare cellule agroinfiltration Giorno 1: Il ceppo di Agrobacterium (es. EH 105 o GV 3101) ospitante il pCass BMV-1 RNA, RNA BMV 2 e 3 1,2 BMV RNA sono coltivate su piastre di agar LB integrato con…

Discussion

Agroinfiltration approccio qui presentate può essere ampiamente applicabile a un'ampia gamma di virus vegetali. Un elemento caratterizzante di questo approccio è sincronizzata consegna di molteplici agroconstruct alla stessa cella, un grave inconveniente comunemente associato solitamente usata inoculazione meccanica di virus vegetali. In vivo e in vitro studi di assemblaggio utilizzando virus del mosaico del bromo come modello può essere condotto in modo efficiente seguono alcuni suggerimenti. (…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare alcuni membri del laboratorio per i loro preziosi suggerimenti per lo sviluppo di agroinfiltration di assemblaggio e test in vitro. Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio presso la University of California. Questo studio è stato sostenuto in parte da un finanziamento della National Science Foundation (cbet-1144237).

Materials

Name of the reagent Company Catalog number
MES Sodium salts Sigma-aldrich M2993
Indocyanine green Sigma-aldrich I2633
Beckman ultracentrifuge Beckman Coulter Model: L8-70M
Centricon-100 column Millipore YM-100
Spectrophotometer Cary 50, Varian Inc. Part number
10068900
Spectrofluorometer Fluorolog 3, Jobin-Yvon. Part number FL3-21

References

  1. Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
  2. Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
  3. Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. . Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).
  4. Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
  5. Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
  6. Sambrrok, J., Russel, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).
  7. Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
  8. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
  9. Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
  10. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).

Play Video

Cite This Article
Chaturvedi, S., Jung, B., Gupta, S., Anvari, B., Rao, A. Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly. J. Vis. Exp. (61), e3645, doi:10.3791/3645 (2012).

View Video