De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

1. Construção das Moscas Moldar uma plataforma a partir da tampa de 35 mm por prato Falcon derretendo a parede lateral e talha-lo para formar um ângulo apropriado e espessura (Figura 1a; Figura 2). Perfurar um furo na plataforma para aceitar a cabeça mosca (Figura 1a, b), de tal modo que as mandíbulas são livremente exposta ao exterior da câmara (Figura 1a). Cortar a extremidade de uma ponta de Pipetman, com o tamanho correspondente a mosca a ser observado. Cole a ponta para a plataforma, como mostrado na Figura 1a para completar as moscas (Figura 2). 2. Preparando o Fly para a observação Starve uma mosca adulta durante 24 horas a 25 ° C antes da experiência, colocando-o num frasco com apenas uma toalha de papel molhado, se a fome é necessário. Anestesiar a mosca, colocando-o em um tubo de plástico 15ml de pé sobre gelo. Usando uma pinça, inserir uma mosca para dentro da câmara doVoa, e empurre a mosca até que ela é incapaz de se mover. Em seguida, insere uma ficha para reter a mosca. (Figura 1a, b). Selar as partes adjacentes dos probóscide proximais (rostro) até à extremidade interior do orifício; Aplicar uma pequena quantidade de luz de cura cola (Tetric EvoFlow) para os lados e acima do rostro a partir do exterior (setas na Figura 3). Também se aplicam a cola a partir do interior das moscas para o espaço entre a parte dorsal da cabeça ea extremidade interior do orifício (Figura 1b). Para permitir a tribuna para se mover livremente, deve ser tomado cuidado para evitar qualquer cola de tocar no pódio usando uma pestana (ou algo semelhante) para espalhar a cola. Finalmente, curar a cola com o mais fraco de iluminação de luz azul suficiente para curar, para evitar danificar a mosca do calor excessivo. Retire a ficha. Um segmento para segurar o rostro parcialmente levantada (seta na Figura 3) pode ser empregue para estabilizar a mosca 'a cabeça, evitando colisão da parte da faringe para SOG e para expor a parte ventral do SOG, especialmente para os terminais pré-sinápticos da imagem Gr5a neurônios 8, que são cobertos por parte da faringe quando a tromba é totalmente retraída. Encher a superfície da plataforma com um açúcar livre de soro fisiológico (em mM): NaCl, 140; KCl, 2; de MgCl2, 4,5; CaCl2, 1,5; e HEPES-NaOH, 5 com um pH de 7,1 10. Esta solução salina sacarose-livre tem tonicidade semelhantes aos de comumente usados ​​sacarose-salinas contendo tais como HL3.1 11. Abra a cápsula cabeça, usando uma lâmina de tungstênio e pinça com pontas afiadas, como tesouras, que é um dispositivo feito sob medida e originalmente concebida pelo Dr. Kageyuki Yamaoka, Japão, cortar a cutícula e traquéia para expor o SOG (Figura 4). A borda ventral da cutícula cabeça foi cortada como ventral possível que o corte de borda dorsal não era tão crítica. Primeiro, faça uma incisão através daborda posterior utilizando uma lâmina de tungsténio. Em seguida, cortam o lado e as bordas anterior utilizando os fórceps afiadas. A peça cutícula corte deve ser levantado com a pinça e removido. Nervos antenas e antenas devem ser cortadas pelas pinças afiadas. A fim de evitar artefactos do movimento durante a gravação, o cérebro deve ser estabilizada através da remoção de certas partes da mosca. Em primeiro lugar, remover seletivamente sacos aéreos entre a SOG e cutícula. Cortar o esófago, do lado da faringe e no final de entrar no SOG para remover a ligação entre a faringe e do cérebro. Em seguida, puxe para fora do músculo 16 12 e, finalmente, retirar qualquer traquéia que liga o cérebro ea cutícula. Nós estabelecemos nossos moscas em fase de um microscópio Olympus BX51WI ligado a um sistema de microscópio fiação disco confocal (Improvision em PerkinElmer) (Figura 5). Uma lente de imersão em água, por exemplo, 40X/0.8 NA, foi imersa no banho (Figura 6 </strong>). 3. Ca 2 + Imagem do Cérebro Ca 2 + imagens usando GCaMP3.0 1, 9 foi realizada através do método estabelecido por Marella et al. 8 (Figura 6). Usando um microscópio confocal disco giratório (Improvision), tomar uma única seção óptica a 4 Hz com tempo de exposição de 122ms usando laser de 491nm de excitação, com foco na região de interesse (um corpo celular de um neurônio motor, ou um interneurônio, ou terminais pré-sinápticos gustativas de neurônios sensoriais) com software Velocity, ver. 4,3 (Improvision). 4. Estimular os Proboscis Aspirar a solução de sacarose 100 mM aquosa para uma agulha hipodérmica com um pavio pequeno (feito a partir de papel Washi japonês, ver Tabela dos reagentes específicos) saliente a partir da ponta (Figura 7). Descarregar uma pequena gota de solução de sacarose para o pavio, em seguida, aspirar que, imediatamente antes da suae aplicando o pavio papel encharcado Washi para a ponta dos probóscide. O pavio papel Washi deve ser aplicado apenas por um instante para evitar a saciedade (Figura 8). Monitorar a resposta extensão da probóscide (PER) comportamento utilizando uma câmara CCD acoplada a um microscópio de dissecção (Figura 5) simultaneamente com Ca 2 + imagem. Os dados devem ser tomadas dentro de uma hora após o início da dissecção, porque a resposta PER não é mantida mais de uma hora sob estas condições. 5. Os resultados representativos Neurónios motores do transferidor rostro, um par de músculos principais responsáveis ​​para a elevação da rostro para a extensão probóscide, têm sido relatados para mostrar as respostas a estímulos robustos doces 13. Figura 9 mostra Ca 2 + sinais através GCaMP3.0 1, 9 expressa por um Gal motorista 4, E49 13, a partir de um corpo celular do neurônio motor. Como mostrado no vídeo, um Robur PER foi observada em sincronia com um aumento no sinal de Ca 2 +. Figura 1. Esquemática do cérebro da mosca ao vivo Imagem e Estágio Eletrofisiologia (moscas). um, as moscas é construído de tal modo que o ângulo da parede permite que a cabeça da mosca a sair recta. Três segmentos da probóscide da mosca são codificados por cores, a tribuna é magenta. A mosca é inserido para dentro da câmara com uma pinça, e uma peça cortada a partir da extremidade de uma ponta de Pipetman está conectado à parte de trás da câmara para bloquear a mosca de escapar. B, O orifício é perfurado para se conformar à cabeça da mosca. As lacunas restantes são selados com fotopolimerizável cola tal como indicado para assegurar que não existem fugas. Depois de a cola ter curado, a ponta Pipetman como uma ficha é removida. É vertida em solução salina das moscas tais que a superfície do cérebro está completamente coberta. Deve ser assegurado que não há vazamento salinação para fora na extremidade anterior da cabeça da mosca. A área sombreada rodeado pela linha tracejada na painel b mostra a peça a ser dissecados. Figura 2. Fotografia das moscas. A parede em forma de crescente de cola (a partir de uma pistola de cola) é feito para controlar o fluxo de solução salina durante a perfusão, e para reduzir a quantidade de solução salina usada. Figura 3. Vista frontal de uma mosca montado em as moscas. Esta imagem mostra como uma mosca é definida nas moscas, e como a cola fotopolimerizável é aplicado em torno da cabeça da mosca (setas) para criar um selo de solução salina prova. Se todas as fugas salino, através das probóscide da mosca, em seguida, o experimento vai falhar. A rosca (pontas de seta) amarrado ao estágio é segurar os probóscide em posição, de modo que não é completamente afastadores Ted. Caso contrário, ele iria obstruir a porção mais ventral do SOG e causar artefatos de movimento. Figura 4. Top-view das moscas com uma mosca dissecados. Esta imagem mostra o SOG exposta de uma remoção cutícula mosca seguinte. O esófago, Músculo 16 e traqueias ligado ao cérebro, bem como seleccionados do ar de sacos também têm sido removido para impedi-los de perturbar o cérebro, o que pode levar a artefactos nos sinais de cálcio. Figura 5. O aparelho de monitorização. Este aparelho é montado a partir de um microscópio Olympus BX51WI ligado a um sistema de microscópio fiação disco confocal (Improvision), e um lado montado Nikon microscópio SMZ800. Esta configuração permite a criação de imagens ao vivo da atividade cerebral durante PER comportamento. 6 "src =" files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg / "/> Figura 6. Fotografias que mostram a vista lateral das moscas. A camada fina de solução salina é ensanduichada entre a lente da imersão em água 40X ea mosca. Figura 7. Esquema para fazer o pavio papel Washi. Gampi-Washi papel é um pergaminho japonês tradicional que é extremamente fina e lisa (Haibara, Japão). Também é muito forte e podem reter uma grande quantidade de líquido. O papel Washi deve ser cortado em um trapézio com dimensões muito específicas; 0,3 mm e 0,7 mm de largura, e 4-5 mm de comprimento (a). Este trapezoidal é então inserido a partir do lado 0,7 mm para dentro da ponta de uma agulha hipodérmica 23 G e também pode ser estabilizado através da inserção de um pino de insectos, que é dobrada para uma forma em V (b). C, O papel torna-se Washi Após a exposição transparentea um líquido, tornando-o ideal para esta experiência. Figura 8. A estimulação dos probóscide sobre as moscas com o Washi pavio. A mecha de papel Washi na ponta de uma agulha hipodérmica é aplicada por um instante utilizando um manipulador Joystick com uma mão. A agulha é ligado através de um tubo flexível a um injector manipulado com a outra mão, para aspiração e de descarga solução de sacarose. Figura 9. Resultados representativos. um, PER comportamento gravado através da câmara CCD instalado no estereomicroscópio. Vistas frontais de uma mosca starved com um probóscide estendidos (setas) antes da estimulação, no estimulação, e depois da estimulação com um feixe contendo 100 mM de solução aquosa de sacarose (ponta de seta). Iluminação é realizado por um laser nm 491 usadopara GCaMP fluorescência. b, Sacarose induzida GCaMP resposta 3,0 no neurônio motor para o transferidor de músculo tribuna no estado faminto. O painel de topo, antes da estimulação, o painel de fundo, imediatamente após a estimulação. Barra de escala, 10 mM. C, a quantificação da sacarose resposta induzida por 3,0 GCaMP. O neurónio motor responde a um estímulo de sacarose por um aumento acentuado na fluorescência seguido por uma fase de recuperação de vários segundos para a linha de base.