Kullanarak Bileşiklerin Biyoaktivite için eşli Nanoinjection ve Ekran için Elektrofizyoloji Testi Drosophila melanogaster Dev Elyaf Sistemi
Summary
A hızlı<em> In vivo</em> Testinin Dev Fiber Sistemi (GDS) kullanılarak nöromodülatör bileşikleri test etmek için<em> Drosophila melanogaster</em> Tarif edilmektedir. GFS elektrofizyolojik kayıtları ile birlikte hayvanın kafasına Nanoinjections nöronlar veya kasları üzerinde bileşiklerin biyoaktivite ortaya çıkarabilir.
Abstract
In vivo aktivitesi in bileşikleri için tarama farmakolojik maddeler 1,2 haline edilebilir aday tanımlamak için bir birinci adım olarak kullanılabilir. Biz aracılık Drosophila melanogaster 3,4 olarak kaçış yanıt nöronal devrenin fonksiyonu üzerine bileşiklerin biyoaktif düzenleyici etkileri tespiti sağlayan bir roman nanoinjection / elektrofizyoloji testi geliştirdi. Bizim Drosophila Dev Fiber Sistemi (GDS, Şekil 1) gibi küçük moleküller veya peptitler gibi bileşikler, farklı türde taranmasına izin verir kullanır ve ancak çok az miktarlarda bir etki uyandırmak gerektirir in vivo test içinde. Buna ek olarak, Drosophila GFS nöronlar veya kas potansiyel hedefler moleküler büyük bir sunar. Bir Çevre Synapsing internöron (PSI) ve Tergo Trochanteral Muscle nöron (TTMN) 5 üzerine kimyasal Dev Elyaf (GF'lerin) elektriksel sinaps (Gap Kavşaklar) yanı sıra (kolinerjik) </> sup. DLMn (Dorsal longitudinal kas nöron) bağlantı PSI Dα7 nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChRs) 6 bağlıdır. Son olarak, atlamadan (TTM) ve uçuş kaslarına (DSB) ile TTMN ve DLMn ve kas kavşağı (NMJ) 7-12 glutamaterjik vardır. Burada, Dev Fiber Sistem 13 ve ne kadar bu devrenin işlevi üzerindeki bileşiğinin etkileri izlemek için gelen elektrofizyolojik intraselüler kayıtlar elde ederken, bir bileşiğin nanoliter miktarlarda enjekte etmek için nasıl gösterilmektedir. Biz bağlantı DLMn için PSI ancak bağlantı veya atlama veya uçuş kasları az NMJ işlevini TTMN için GF bozan methyllycaconitine sitrat (MLA), bir nAChR antagonisti ile testin özgüllük gösterirler.
Bu video başlamadan önce bunu dikkatle izlemek ve D. Melan ve Dev Fiber Yolu gelen "Elektrofizyolojik Kayıtlar başlıklı Jüpiter Video aşina olmak çok önemlidirVideo Burada vermiş olduğumuz Augustin ve ark 7, gelen ogaster "Bu mevcut teknik bir genişleme olarak tasarlanmıştır. Burada biz sadece eşleştirilmiş nanoinjections ve izleme tekniğinin yanı sıra üzerinde ayrıntılı elektrofizyolojik yöntem ve odak kullanın.
Protocol
Discussion
Burada sunulan nanoinjection / elektrofizyoloji bioassay meyve sineği sinir sisteminde bileşiklerin hızlı bir tarama için olanak sağlar. Bu, iyi karakterize nöronal devrenin moleküler hedefler çeşitli üzerinde bir etki ortaya çıkarmak üzere bir bileşik küçük miktarlarda gerektirir vivo tekniğin bir yenilik arzetmektedir. Bu yöntem, bilinmeyen toksinler ticari olarak temin farmakolojik maddeler için farklı bileşiklerin biyoaktivitenin test etmek için kullanılabilir.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz özellikle Aline Yonezawa Mari laboratuar ve Godenschwege laboratuar, üyeleri tanımak istiyoruz, yorum ve bu protokol ile yardımcı olacaktır. Bu çalışma Nörolojik Hastalıklar Ulusal Enstitüsü ve FM ve TAG İnme hibe R21NS06637 tarafından finanse edildi; AB Ulusal Bilim Vakfı ödülü sayısı 082.925, URM tarafından finanse edildi: Gelecekte araştırmacılar için Bütünleştirici Biyoloji.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
| Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
| Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
| Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
| Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
| Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
| Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
| Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
| Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
| Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
| Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
| Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
| Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
| Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
| Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
| Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |
References
- Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
- Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).
- Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors. Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).
- Lewis, R. J. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters. IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS biology. 4, e63 (2006).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).
- Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses. Nature. 219, 1169-1172 (1968).
- Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).
- Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron. 19, 1237-1248 (1997).
- Qin, G. Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).
- Schuster, C. M. Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science. 254, 112-114 (1991).
- Tanouye, M. A., Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila. Journal of. 44, 405-421 (1980).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).
- Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. . Drosophila Neurobiology. , 215-224 (2010).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study. J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).
- Thomas, J. B., Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).
- Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway. 유전학. 126, 1045-1059 (1990).
- Gorczyca, M., Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).
- Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).
- Mejia, M. A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit. Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).
- Stork, T. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
