Summary

Kopplade Nanoinjection och elektrofysiologi analys för att undersöka Bioaktivitet hos föreningar med hjälp av Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Published: April 15, 2012
doi:

Summary

En snabb<em> In vivo</em> Analys för att testa neuromodulatory föreningar med hjälp av Giant Fiber System (GFS) av<em> Drosophila melanogaster</em> Beskrivs. Nanoinjections i huvudet av djuret tillsammans med elektrofysiologiska inspelningar av GFS kan avslöja bioaktivitet av föreningar på nervceller och muskler.

Abstract

Avsökning av föreningar för in vivo-aktivitet kan användas som ett första steg för att identifiera kandidater som kan utvecklas till farmakologisk agens 1,2. Vi utvecklat en ny nanoinjection / elektrofysiologi analys som möjliggör detektering av bioaktiva modulerande effekter av föreningar på funktionen hos en neuronal krets som medierar flyktrespons i Drosophila melanogaster 3,4. Vår analys in vivo, som använder Drosophila Giant fibersystemet (GFS, figur 1) medger screening av olika typer av föreningar, såsom små molekyler eller peptider, och kräver endast minimala mängder för att framkalla en effekt. Dessutom erbjuder Drosophila GFS ett stort antal potentiella molekylära mål på nervceller och muskler. Giant fibrer (GF) synaps elektriskt (gap junctions) och kemiskt (kolinergisk) på en perifer Synapsing interneuron (PSI) och den Tergo trochanter-Muskel neuronen (TTMn) 5 </sup>. PSI till DLMn (Dorsal längsgående muskeln neuron) anslutning beror på Dα7 nikotinacetylkolinreceptorer (nAChR) 6. Slutligen, den neuromuskulära korsningar (NMJ) av TTMn och DLMn med hopp (TTM) och muskler Flight (DLM) är glutamaterg 7-12. Här visar vi hur du ska injicera metod i nanoliter mängder av en förening, medan få elektrofysiologiska intracellulära inspelningar från Giant Fiber System 13 och hur man övervaka effekterna av föreningen på funktionen av denna krets. Vi visar specificiteten hos analysen med methyllycaconitine citrat (MLA), en nAChR-antagonist, som stör PSI till DLMn förbindelse men inte GF att TTMn anslutning eller funktionen av NMJ vid hopp eller muskler flygning.

Innan du börjar denna video är det viktigt att du noggrant titta på och bekanta dig med Jové video med titeln "Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber vägen för D. Melanogaster "från Augustin et al 7, som video presenteras här är avsedd som en expansion till denna befintliga teknik. Här använder vi elektrofysiologiska inspelningar metoden och fokus i detalj endast om tillsättning av de parade nanoinjections och övervakningsteknik.

Protocol

1. Elektrofysiologi Rigg Set-up Erforderlig utrustning för elektrofysiologi riggen set-up beskrivs i detalj av Augustin et al. i denna tidskrift 14. Se till denna artikel för en detaljerad förklaring av de nödvändiga elektrofysiologiska apparater. Ändra den tidigare beskrivna elektrofysiologi rig set-up 14 genom att lägga till 1/6 mikromanipulator, som håller nanoinjector. För enkel åtkomst till huvudet av djuret bör placeras mellan de två stimulerande elek…

Discussion

Den nanoinjection / elektrofysiologi bioassay presenteras här möjliggör en snabb screening av föreningar i nervsystemet av bananfluga. Detta är en ny in vivo-teknik som kräver små mängder av en förening för att framkalla en effekt på en mängd olika molekylära mål i en väl karakteriserad neuronala krets. Denna metod kan användas för att testa bioaktiviteten hos olika föreningar, av okända toxiner med kommersiellt tillgängliga farmakologiska medel.

Här har vi visa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi skulle vilja tacka ledamöterna i Mari lab och Godenschwege lab, i synnerhet Aline Yonezawa, för kommentarer och hjälp med detta protokoll. Detta arbete har finansierats av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke bidrag R21NS06637 till FM och TAG, AB har finansierats av National Science Foundation Award antalet 082.925, URM: Integrativ biologi för framtida forskare.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 1.0mm OD, 0.58mm ID
Stimulator Grass Instruments Model S48  
Amplifier Getting Instruments Inc. Model 5A  
Data acquisition Software: Digidata Molecular Devices Model 1440A  
Data collection software: pCLAMP Molecular Devices Version 10  
Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator AmScope SM-4T
Model HL250-AR
 
Dissecting scope for mounting AmScope SM-2TZ  
Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base World Precision Instruments Model # M3301
Kite: Model # KITE-M3-L
 
Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) Bloomington Stock center Stock # 3892  
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 700c  
Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments Catalogue # 4878 1.14mm OD, 0.5mm ID
Silicon oil Fisher Catalogue # S159-500  
Beveler Sutter Instrument Co. K.T. Brown Type
Model # BV-10
 
Nanoliter2000 World Precision Instruments Catalogue # B203XVY  
Blue food coloring McCormick N/A Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative).
Methyllycaconitine citrate (MLA) Tocris Bioscience Catalogue # 1029  
Plastic wax sticks Hygenic Corporation (Akron Ohio USA)    

References

  1. Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
  2. Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).
  3. Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors. Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).
  4. Lewis, R. J. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters. IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).
  5. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
  6. Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS biology. 4, e63 (2006).
  7. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).
  8. Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses. Nature. 219, 1169-1172 (1968).
  9. Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).
  10. Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron. 19, 1237-1248 (1997).
  11. Qin, G. Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).
  12. Schuster, C. M. Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science. 254, 112-114 (1991).
  13. Tanouye, M. A., Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila. Journal of. 44, 405-421 (1980).
  14. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).
  15. Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. . Drosophila Neurobiology. , 215-224 (2010).
  16. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study. J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).
  17. Thomas, J. B., Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).
  18. Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway. 유전학. 126, 1045-1059 (1990).
  19. Gorczyca, M., Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).
  20. Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).
  21. Mejia, M. A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit. Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).
  22. Stork, T. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
check_url/kr/3597?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System. J. Vis. Exp. (62), e3597, doi:10.3791/3597 (2012).

View Video