Summary

Парные Nanoinjection и электрофизиологии Анализ для выявления биологической активности соединений с использованием DROSOPHILA MELANOGASTER Гигантские системы волоконно

Published: April 15, 2012
doi:

Summary

Быстрый<em> В естественных условиях</em> Анализ для проверки нейромодуляторных соединений с использованием гигантских системы волокон (GFS) в<em> DROSOPHILA MELANOGASTER</em> Описано. Nanoinjections в голову животного, а также электрофизиологические записи GFS может выявить биологическую активность соединений на нейроны или мышц.

Abstract

Скрининга соединений в естественных условиях деятельности могут быть использованы в качестве первого шага для выявления кандидатов, которые могут быть разработаны в 1,2 фармакологических агентов. Мы разработали новый nanoinjection / электрофизиологии анализа, что позволяет обнаружить эффекты биологически активных соединений модулирующим на функции нейронов схема, которая является посредником побега ответ дрозофилы MELANOGASTER 3,4. Наш анализ в естественных условиях, в котором используется волоконно дрозофилы гигантские System (GFS, рис. 1) позволяет скрининг различных типов соединений, таких как малые молекулы или пептиды, и требует лишь минимальных количествах, чтобы вызвать эффект. Кроме того, дрозофилы GFS предлагает большой выбор потенциальных молекулярных мишеней на нейроны или мышц. Гигантские волокна (GFS) синапсов электрически (щелевые контакты), а также химически (холинергических) на периферийных Synapsing интернейронов (PSI) и Tergo Trochanteral мышцы нейрона (TTMn) 5 </sup>. PSI в DLMn (спинного продольного нейронов мышц) соединения зависит от Dα7 никотиновые рецепторы ацетилхолина (nAChRs) 6. И, наконец, нервно-мышечных соединений (NMJ) в TTMn и DLMn со скачком (TTM) и летных мышц (DLM) являются глутаматергической 7-12. Здесь мы показываем, как придать nanoliter количества соединений, при получении электрофизиологических внутриклеточных записей из системы гигантских волокон 13 и как осуществлять мониторинг воздействия соединений на функции этой цепи. Мы покажем специфику анализа с methyllycaconitine цитрата (MLA), нАХР антагонист, который нарушает PSI в DLMn связи, но не ГФ TTMn связи или функции NMJ в прыжке или полете мышцы.

Перед началом этого видео очень важно, чтобы вы внимательно смотреть и познакомиться с Юпитер видео под названием "Электрофизиологические Записи с Гигантские Путь волоконно Д. Melanogaster »от Августина и др. 7, как видео, представленные здесь, предназначены в качестве расширения для этого существующий метод. Здесь мы используем метод электрофизиологической записи и сосредоточиться подробно только на того парных nanoinjections и мониторинга техники.

Protocol

1. Электрофизиология Rig Настройка Необходимое оборудование для установки электрофизиологии настройки подробно описан Августином и др.. В этом журнале 14. Пожалуйста, обратитесь к этой статье подробное объяснение электрофизиологических аппараты необходимы. Измен?…

Discussion

Nanoinjection / электрофизиологии биопроб, представленные здесь позволяет быстрого скрининга соединений в нервной системе плодовой мушки. Это роман в естественных условиях техника, которая требует небольшого количества соединений, чтобы выявить влияние на различные молекулярные мише…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы выразить признательность членам Марий лаборатории и Godenschwege лаборатории, в частности, Алина Йонезава, комментарии и помощь с этим протоколом. Эта работа финансировалась Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта грант R21NS06637 в FM и TAG, AB финансировалось Национальным научным фондом награды число 082925, URM: интегративной биологии для будущих исследователей.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 1.0mm OD, 0.58mm ID
Stimulator Grass Instruments Model S48  
Amplifier Getting Instruments Inc. Model 5A  
Data acquisition Software: Digidata Molecular Devices Model 1440A  
Data collection software: pCLAMP Molecular Devices Version 10  
Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator AmScope SM-4T
Model HL250-AR
 
Dissecting scope for mounting AmScope SM-2TZ  
Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base World Precision Instruments Model # M3301
Kite: Model # KITE-M3-L
 
Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) Bloomington Stock center Stock # 3892  
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 700c  
Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments Catalogue # 4878 1.14mm OD, 0.5mm ID
Silicon oil Fisher Catalogue # S159-500  
Beveler Sutter Instrument Co. K.T. Brown Type
Model # BV-10
 
Nanoliter2000 World Precision Instruments Catalogue # B203XVY  
Blue food coloring McCormick N/A Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative).
Methyllycaconitine citrate (MLA) Tocris Bioscience Catalogue # 1029  
Plastic wax sticks Hygenic Corporation (Akron Ohio USA)    

References

  1. Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
  2. Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).
  3. Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors. Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).
  4. Lewis, R. J. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters. IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).
  5. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
  6. Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS biology. 4, e63 (2006).
  7. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).
  8. Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses. Nature. 219, 1169-1172 (1968).
  9. Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).
  10. Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron. 19, 1237-1248 (1997).
  11. Qin, G. Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).
  12. Schuster, C. M. Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science. 254, 112-114 (1991).
  13. Tanouye, M. A., Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila. Journal of. 44, 405-421 (1980).
  14. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).
  15. Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. . Drosophila Neurobiology. , 215-224 (2010).
  16. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study. J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).
  17. Thomas, J. B., Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).
  18. Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway. 유전학. 126, 1045-1059 (1990).
  19. Gorczyca, M., Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).
  20. Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).
  21. Mejia, M. A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit. Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).
  22. Stork, T. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
check_url/kr/3597?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System. J. Vis. Exp. (62), e3597, doi:10.3791/3597 (2012).

View Video