Sammenkoblede Nanoinjection og Elektrofysiologi Assay til skjerm for bioaktivitet av forbindelser ved hjelp av Drosophila melanogaster Giant Fiber System
Summary
En rask<em> In vivo</em> Analysen for å teste for neuromodulatory forbindelser ved hjelp av Giant Fiber System (GFS) av<em> Drosophila melanogaster</em> Er beskrevet. Nanoinjections i hodet på dyret sammen med elektrofysiologiske opptak av GFS kan avsløre bioaktivitet av forbindelser på nevroner og muskler.
Abstract
Screening forbindelser for in vivo aktivitet kan brukes som et første skritt for å identifisere kandidater som kan utvikles til farmakologisk agenter 1,2. Vi utviklet en roman nanoinjection / elektrofysiologi analysen som tillater påvisning av bioaktive regulerende effekt av forbindelser på funksjonen til en neuronal krets som medierer flukten respons i Drosophila melanogaster 3,4. Vår in vivo-forsøk, som bruker Drosophila Giant Fiber System (GFS, figur 1) tillater screening av ulike typer forbindelser, for eksempel små molekyler eller peptider, og krever bare minimale mengder å lokke fram en effekt. I tillegg tilbyr Drosophila GFS et stort utvalg av potensielle molekylære mål på nerveceller og muskler. The Giant fiber (GFS) synapse elektrisk (Gap veikryss) samt kjemisk (kolinerge) på en ytre Synapsing Interneuron (PSI) og Tergo Trochanteral Muscle nervecellen (TTMn) 5 </sup>. PSI til DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle nevron) tilkoblingen er avhengig Dα7 nikotin acetylkolinreseptorer (nAChRs) 6. Til slutt, den nevromuskulære knutepunktene (NMJ) av TTMn og DLMn med hopp (TTM) og fly muskler (DLM) er glutamatergic 7-12. Her viser vi hvordan du injiserer nanoliter mengder av et stoff, mens skaffe elektrofysiologiske intracellulære opptak fra Giant Fiber System 13, og hvordan å overvåke virkningene av det sammensatte på funksjonen til denne kretsen. Vi viser spesifisitet av analysen med methyllycaconitine citrat (MLA), en nAChR antagonist, som forstyrrer PSI til DLMn tilkobling, men ikke GF å TTMn tilkobling eller funksjonen av NMJ på hopp eller fly muskler.
Før du begynner denne videoen er det viktig at du nøye se og bli kjent med Jove video med tittelen "Elektrofysiologiske Opptak fra Giant Fiber Pathway av D. melanogaster "fra Augustin et al 7, som video som presenteres her er ment som en utvidelse til denne eksisterende teknikken. Her bruker vi elektrofysiologisk innspillinger metode og fokus på detaljer bare om tilsetting av de sammenkoblede nanoinjections og overvåking teknikk.
Protocol
Discussion
Den nanoinjection / elektrofysiologi bioassay presenteres her åpner for en rask screening av forbindelser i nervesystemet av bananflue. Dette er en roman in vivo teknikk som krever små mengder av et sammensatt for å lokke fram en effekt på en rekke molekylære mål i en godt karakterisert neuronal krets. Denne metoden kan brukes til å teste bioaktivitet av ulike forbindelser, fra ukjente giftstoffer til kommersielt tilgjengelige farmakologiske agenter.
Her demonstrerte vi funks…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke medlemmene av Mari lab og Godenschwege lab, særlig Aline Yonezawa, for kommentarer og hjelp med denne protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av National Institute for nevrologiske lidelser og Stroke stipend R21NS06637 til FM og TAG; AB ble finansiert av National Science Foundation award nummer 082925, URM: Integrative Biology for fremtidige forskere.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
| Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
| Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
| Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
| Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
| Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
| Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
| Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
| Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
| Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
| Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
| Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
| Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
| Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
| Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
| Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |
References
- Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
- Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).
- Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors. Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).
- Lewis, R. J. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters. IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS biology. 4, e63 (2006).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).
- Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses. Nature. 219, 1169-1172 (1968).
- Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).
- Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron. 19, 1237-1248 (1997).
- Qin, G. Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).
- Schuster, C. M. Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science. 254, 112-114 (1991).
- Tanouye, M. A., Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila. Journal of. 44, 405-421 (1980).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).
- Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. . Drosophila Neurobiology. , 215-224 (2010).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study. J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).
- Thomas, J. B., Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).
- Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway. 유전학. 126, 1045-1059 (1990).
- Gorczyca, M., Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).
- Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).
- Mejia, M. A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit. Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).
- Stork, T. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
