Nanoinjection paires et test d'électrophysiologie à l'écran de la bioactivité des composés en utilisant le Drosophila melanogaster Système de fibre géant
Summary
Un rapide<em> In vivo</em> Test pour tester des composés neuromodulateurs en utilisant le système de fibre géante (GFS) de<em> Drosophila melanogaster</em> Est décrite. Nanoinjections dans la tête de l'animal ainsi que des enregistrements électrophysiologiques de la SFP peut révéler la bioactivité des composés sur les neurones ou les muscles.
Abstract
Criblage de composés pour l'activité in vivo peut être utilisé en tant que première étape d'identifier des candidats qui peuvent être développés en 1,2 agents pharmacologiques. Nous avons développé un roman nanoinjection / électrophysiologie dosage qui permet la détection des effets modulateurs de composés bioactifs sur la fonction d'un circuit neuronal qui sert de médiateur de la réaction de fuite chez Drosophila melanogaster 3,4. Notre test in vivo, qui utilise le système de Drosophila fibre géante (GFS, Figure 1) permet le dépistage des différents types de composés, tels que de petites molécules ou des peptides, et exige que des quantités minimales à obtenir un effet. En outre, le GFS Drosophila offre une grande variété de cibles moléculaires potentielles sur les neurones ou les muscles. Les fibres géantes (GFS) synapse électrique (Gap jonctions) ainsi que chimiquement (cholinergique) sur une synapse périphérique Interneuron (PSI) et le Tergo Muscle Trochanteral neurone (TTMn) 5 </sup>. Le PSI à DLMn (dorsale neurone musculaire longitudinale) de connexion dépend de Dα7 récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAChR) 6. Enfin, la jonction neuromusculaire (JNM) de l'TTMn et le DLMn avec le saut (TTM) et les muscles de vol (DLM) sont glutamatergique 7-12. Ici, nous montrons comment injecter des quantités nanolitre d'un composé, tout en obtenant électrophysiologiques des enregistrements intracellulaires du système de fibre géante 13 et la façon de surveiller les effets du composé sur la fonction de ce circuit. Nous montrons la spécificité du test avec du citrate de methyllycaconitine (MLA), un antagoniste nAChR, qui perturbe le PSI à DLMn connexion, mais pas le GF TTMn connexion ou la fonction de la jonction neuromusculaire au saut ou les muscles de vol.
Avant de commencer cette vidéo, il est essentiel que vous regardez attentivement et se familiariser avec la vidéo intitulée "JoVE enregistrements électrophysiologiques de la voie des fibres Géant de D. melanogaster "de Augustin et al 7, comme la vidéo présentée ici est conçu comme une extension de cette technique existante. Ici, nous utilisons la méthode électrophysiologique des enregistrements et de se concentrer en détail que sur l'ajout des nanoinjections appariés et de la technique de surveillance.
Protocol
Discussion
Le bio-essai nanoinjection / électrophysiologie présentée ici permet de dépistage rapide de composés dans le système nerveux de la mouche des fruits. C'est un roman dans la technique in vivo qui nécessite de petites quantités d'un composé de susciter un effet sur une variété de cibles moléculaires dans un circuit neuronal bien caractérisé. Cette méthode peut être utilisée pour tester la bioactivité des composés différents, à partir de toxines inconnues disponibles dan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Mari et le laboratoire Godenschwege, en particulier Aline Yonezawa, pour les commentaires et l'aide à ce protocole. Ce travail a été financé par l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies de subvention à la bande FM R21NS06637 et TAG; AB a été financé par le nombre National Science prix de la Fondation 082925, URM: biologie intégrative pour les futurs chercheurs.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
| Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
| Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
| Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
| Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
| Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
| Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
| Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
| Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
| Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
| Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
| Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
| Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
| Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
| Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
| Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |
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