Gekoppelde Nanoinjection en Elektrofysiologie test voor het screenen op bioactiviteit van verbindingen met behulp van de Drosophila melanogaster Giant Fiber System
Summary
Een snelle<em> In vivo</em> Test om te testen op neuromodulatory verbindingen met behulp van de Giant Fiber System (GFS) van<em> Drosophila melanogaster</em> Beschreven. Nanoinjections in de kop van het dier, samen met elektrofysiologische opnames van de SBO kan onthullen bioactiviteit van verbindingen op neuronen en spieren.
Abstract
Screening verbindingen in vivo activiteit kan worden gebruikt als eerste stap kandidaten die kunnen worden ontwikkeld tot farmacologische agentia 1,2 identificeren. We ontwikkelden een nieuwe nanoinjection / elektrofysiologische test die de detectie van bioactieve modulerende effecten van stoffen op de functie van een neuronale circuit dat bemiddelt de ontsnapping respons bij Drosophila melanogaster 3,4 mogelijk maakt. De in vivo assay gebruikt Drosophila Giant vezelsysteem (GFS, figuur 1) kan screening van verschillende verbindingen, zoals kleine moleculen of peptiden en vereist slechts minimale hoeveelheden te wekken effect. Daarnaast is de Drosophila GFS biedt een grote verscheidenheid van mogelijke moleculaire doelwitten op neuronen en spieren. De Giant Fibers (GFS) synaps elektrisch (gap junctions) als chemisch (cholinerge) op een Perifere Synapsing Interneuron (PSI) en de Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn) 5 </sup>. De PSI naar DLMn (Dorsale Longitudinale Muscle neuron) aansluiting is afhankelijk van Dα7 nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs) 6. Ten slotte is de neuromusculaire knooppunten (NMJ) van de TTMn en de DLMn met de sprong (TTM) en vliegspieren (DLM) zijn glutamaat 7-12. Hier hebben we laten zien hoe je nanoliter hoeveelheden van een stof te injecteren, terwijl het verkrijgen van elektrofysiologische intracellulaire opnames van de Giant Fiber System 13 en hoe de effecten van de verbinding op de functie van dit circuit te controleren. We tonen specificiteit van de test met methyllycaconitine citraat (MLA), een nAChR antagonist, die de PSI om de verbinding DLMn maar niet de GF om verbinding of de functie van de NMJ op de sprong of vlucht spieren TTMn verstoort.
Alvorens te beginnen met deze video is het belangrijk dat je zorgvuldig in de gaten en vertrouwd raken met de Jove video met de titel "elektrofysiologische registraties van de Giant Fiber Pathway van D. Melanogaster "van Augustin et al. 7 de video hier gepresenteerde is bedoeld als een uitbreiding van deze bestaande techniek. Hier elektrofysiologische opnames methode en focus gebruiken in bijzonderheden over de toevoeging van de gepaarde nanoinjections en meettechniek.
Protocol
Discussion
De nanoinjection / elektrofysiologie bioassay hier gepresenteerde zorgt voor een snelle screening van verbindingen in het zenuwstelsel van de fruitvlieg. Dit is een nieuwe in vivo techniek dat kleine hoeveelheden van een verbinding vereist invloed op een verscheidenheid van eiwitten wekken in een goed gekarakteriseerd neuronale circuit. Deze methode kan worden gebruikt om de biologische activiteit van verschillende verbindingen testen van onbekende toxinen in de handel verkrijgbare farmacologische agentia.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen de leden van de Mari-lab en de Godenschwege lab, te erkennen in het bijzonder Aline Yonezawa, voor commentaar en hulp bij dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke subsidie R21NS06637 naar FM-en TAG; AB werd gefinancierd door de National Science Foundation Award nummer 082925, URM: Integratieve Biologie voor toekomstige onderzoekers.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
| Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
| Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
| Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
| Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
| Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
| Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
| Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
| Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
| Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
| Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
| Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
| Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
| Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
| Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
| Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |
References
- Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
- Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).
- Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors. Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).
- Lewis, R. J. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters. IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS biology. 4, e63 (2006).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).
- Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses. Nature. 219, 1169-1172 (1968).
- Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).
- Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron. 19, 1237-1248 (1997).
- Qin, G. Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).
- Schuster, C. M. Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science. 254, 112-114 (1991).
- Tanouye, M. A., Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila. Journal of. 44, 405-421 (1980).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).
- Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. . Drosophila Neurobiology. , 215-224 (2010).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study. J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).
- Thomas, J. B., Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).
- Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway. 유전학. 126, 1045-1059 (1990).
- Gorczyca, M., Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).
- Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).
- Mejia, M. A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit. Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).
- Stork, T. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
