تقرن Nanoinjection والفحص الكهربية للكشف عن النشاط الحيوي للمركبات باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن نظام الألياف العملاق
Summary
سريع<em> في الجسم الحي</em> فحص لاختبار المركبات neuromodulatory باستخدام نظام الألياف العملاق (GFS) من<em> ذبابة الفاكهة السوداء البطن</emيوصف>. يمكن Nanoinjections في رأس الحيوان جنبا إلى جنب مع التسجيلات الكهربية من GFS كشف النشاط الحيوي لمركبات على الخلايا العصبية أو العضلات.
Abstract
ويمكن استخدام مركبات الكشف عن النشاط في الجسم الحي، كخطوة أولى لتحديد المرشحين التي يمكن وضعها في 1،2 كلاء الدوائية. وضعنا رواية nanoinjection / الكهربية الفحص الذي يسمح للكشف عن الآثار تغييري من المركبات النشطة بيولوجيا على وظيفة الدائرة العصبية التي تتوسط استجابة الهروب في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 3،4. لدينا في فحص الجسم الحي، والذي يستخدم الألياف العملاق ذبابة الفاكهة نظام (GFS، الشكل 1) يسمح للفحص من أنواع مختلفة من المركبات، مثل الجزيئات الصغيرة أو الببتيد، ويتطلب سوى كميات ضئيلة للحصول تأثير. بالإضافة إلى ذلك، GFS ذبابة الفاكهة يقدم مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأهداف الجزيئية المحتملة على الخلايا العصبية أو العضلات. الألياف العملاق (GFS) المشبك كهربائيا (GAP المفارق)، فضلا عن كيميائيا (الكوليني) في الصعود إلى عصبون Synapsing الطرفية (PSI) وTrochanteral Tergo الخلايا العصبية العضلية (TTMn) 5 </سوب>. هذه المبادرة إلى الاتصال (الخلايا العصبية الظهرية العضلات الطولية) DLMn يعتمد على Dα7 acetylcholine المستقبلات النيكوتينية (nAChRs) 6. وأخيرا، فإن الوصلات العصبية والعضلية (NMJ) من TTMn وDLMn ومع القفزة (الايراد) وعضلات الطيران (DLM) هي glutamatergic 7-12. هنا، نحن لشرح كيفية حقن كميات نانولتر من مركب، في حين الحصول على تسجيلات داخل الخلايا الكهربية من نظام الألياف العملاق 13 وكيفية رصد آثار مجمع على وظيفة من هذه الدائرة. نعرض خصوصية مقايسة مع سترات methyllycaconitine (MLA)، وهو خصم nAChR، والذي يعطل هذه المبادرة إلى DLMn اتصال ولكن ليس إلى GF TTMn اتصال أو وظيفة NMJ في الوثب أو عضلات الطيران.
قبل البدء في هذا الفيديو من الأهمية بمكان أن تشاهد بعناية وتصبح مألوفة مع الفيديو [جوف] بعنوان "تسجيلات الكهربية من مسار الألياف العملاق من melan د.والمقصود ogaster "من أوغسطين وآخرون 7، كما قدم شريط الفيديو هنا كما توسع لهذه التقنية القائمة. هنا نستخدم طريقة التسجيلات الكهربية والتركيز في التفاصيل فقط على إضافة nanoinjections تقرن وتقنية الرصد.
Protocol
Discussion
والأحيائي nanoinjection / الكهربية المقدمة هنا يسمح لفحص السريع للمركبات في الجهاز العصبي من ذبابة الفاكهة. هذه هي رواية في تقنية الجسم الحي الذي يتطلب كميات صغيرة من مركب للحصول تأثير على مجموعة متنوعة من الأهداف الجزيئية في دائرة العصبية جيدا تتميز. ويمكن استخد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف أعضاء مختبر ماري ومختبر Godenschwege، في Yonezawa ألين وجه الخصوص، للتعليق عليها والمساعدة في هذا البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية R21NS06637 إلى منح وزير الخارجية وTAG، وكان يمول من قبل عدد AB الوطنية للعلوم جائزة مؤسسة 082925، URM: البيولوجيا التكاملية للباحثين في المستقبل.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
| Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
| Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
| Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
| Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
| Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
| Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
| Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
| Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
| Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
| Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
| Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
| Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
| Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
| Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
| Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |
References
- Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
- Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).
- Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors. Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).
- Lewis, R. J. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters. IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS biology. 4, e63 (2006).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).
- Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses. Nature. 219, 1169-1172 (1968).
- Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).
- Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron. 19, 1237-1248 (1997).
- Qin, G. Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).
- Schuster, C. M. Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science. 254, 112-114 (1991).
- Tanouye, M. A., Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila. Journal of. 44, 405-421 (1980).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).
- Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. . Drosophila Neurobiology. , 215-224 (2010).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study. J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).
- Thomas, J. B., Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).
- Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway. 유전학. 126, 1045-1059 (1990).
- Gorczyca, M., Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).
- Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).
- Mejia, M. A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit. Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).
- Stork, T. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
