Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

1. Animal voorbereiding Belangrijke informatie: BM celsuspensies en thymus-transplantaties werden uitgevoerd in aseptische omstandigheden. De BM suspensies werden bereid in de kappen van onze celkweek kamer, terwijl de thymus transplantatie werd uitgevoerd in de operatiekamer zich in ons dierenverblijf. Met het oog op te houden en garanderen dat deze aseptische omstandigheden, waren we niet toegestaan ​​om onze video op te nemen in deze plaatsen. Echter zijn alle chirurgische materialen geautoclaveerd en chirurgische bank is eerder gereinigd met Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc) en 70% ethanol. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en ze waren in overeenstemming met de Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) richtlijnen. De goedkeuring ID-nummer is AO10/2010. Alle beeld experimenten waren terminal procedures en de dieren werden onmiddellijk gedood na het einde van het beeldovername. De gedetailleerde procedure is als volgt: Bestralen (met een γ-bestraler) 8 weken oude muizen Naakt met 900 rads de endogene hematopoietische precursors vernietigen in het beenmerg (BM). Na bestraling, de terugkeer van de dieren naar hun kooien totdat u de voorbereiding van de donor BM cellen voor intraveneuze injectie en verder BM reconstitutie. Deze BM overdracht werd uitgevoerd 1 uur na bestraling. Scheid de BM donordieren. Dij-en bovenbenen van de achterste ledematen van een dier zijn over het algemeen voldoende te reconstrueren tot 3 ontvanger dieren. Na euthanasie met CO 2, verwijder de achterste ledematen en verwijder de huid en spieren van de botten. Snij het gesloten eind van elk bot en spoelen met PBS (of RPMI) of fijnmaken allemaal in een mortier met stamper met 2 ml PBS (of RPMI) de BM verwijderen. Breek de BM structuur in een single-celsuspensie door herhalingen van krachtige aspiratie using een P1000 pipet. Als alternatief kunt u ook langs de BM gedurende een 21G naald meerdere malen. Centrifuge (400g, 5 min, RT), opnieuw te schorten cellen in PBS, en injecteer intraveneus in uw naakt-bestraalde ontvangers. In onze experimenten gebruikten we BM van Foxp3-KI GFP / GFP muizen waar alle regulerende T-cellen (Tregs) zal uiten GFP 1. Acceptatie van de donor BM gebeurt in de eerste dagen na de overdracht, omdat niet-BM-gereconstitueerde dieren kunnen niet overleven meer dan 14 dagen. Echter, men moet wachten tot 4 tot 6 weken volledig herstel van BM compartimenten maken. Bactrim (Roche) werd toegevoegd aan het water (2 mg / ml) gedurende de eerste week na bestraling om het risico van bacteriële infecties verminderen. Embryonale thymus transplantatie werd reeds beschreven 2. In het kort, start broedparen van isogene muizen en controleer voor het aansluiten (bewijs van coïtus) elke dag. Aparte aangesloten vrouwen en CO 2-euthanaseren hen op dag 15 van pregnancy (observatie van de stekker is dag 1 van de zwangerschap). Verwijder de embryo's en de zwezeriken. Plaats de embryonale zwezeriken in koude PBS tot overdracht. De thymus transplantatie Anesthetize BM-ontvanger Naakt muizen met ketamine (120 ug / g van muis gewicht) / xylazine (16 ug / g van muis gewicht) te voeren en deze op een verwarmingskussen te houden bij 37 ° C tot ze onbewuste. Operatief bloot de nier naar de transplantatie van de zwezeriken uit te voeren. Eerst scrub de huid met ChloraPrep (Carefusion Inc) en 70% ethanol. Dan een 1 cm gesneden op de huid van de rug-laterale lichaamsdeel van het dier, 2 mm balg de laatste thoracale rib. Snijd de peritoneale holte en trek de nier van deze holte. Maak een kleine oppervlakkige snede in de nier capsule met een scalpel. Met behulp van een tang met een zeer dunne tip een zakje onder de nier capsule van de ontvanger muis en voeg tot 4 thymus lobben in dit zakje. Zet de nier b ack op zijn plaats, hechten de peritoneale holte met een of twee steken en sluit de muis huid met behulp van dezelfde hechtdraad methode. Als alternatief kan hechtingen worden gedaan met behulp van chirurgische lijm. Injecteer pijnstillende (Butorfanol bij 5 mg / kg) subcutaan direct na het beëindigen van de operatie om dieren pijn te vermijden en de dieren te houden in een verwarmings-pad tot ze beginnen te herstellen van anesthesie. Muizen individueel gekooid de eerste 3 dagen na transplantatie kooi mates voorkomen verwijderen van de steken. Verwijder steken na 1 week. Naakt muizen geen T-cellen. Daarom kunt u de thymus transplantaat acceptatie te evalueren door het volgen van het percentage van CD4 + of CD8 + T-cellen in het bloed. Eenmaal per week, 2 weken na transplantatie thymus, bloeden en vlekken de dieren het bloed met anti-CD4 en anti-CD8 monoklonale antilichamen (MAbs). Wanneer de CD4: CD8 ratio ongeveer 2:1, de getransplanteerde thymus volledig functioneel (figuur 1). "> 2. Intravitale beeldacquisitie Bereid alle materialen die u nodig hebt van te voren en leg ze opzij. Verdoven dieren met ketamine / xylazine (dezelfde doses beschreven in punt 1.5) en ze op een verwarmingskussen te plaatsen bij 37 ° C. Injecteer 100 ui Rhodamine B-isothiocyanaat-Dextran (20 mg / ml in PBS) intraveneus toekomstige visualisatie van de bloedstroom mogelijk. Bloot de nier die de getransplanteerde thymus volgens het protocol eerder beschreven in punt 1.6. De nier te voorkomen terugkeren naar zijn oorspronkelijke positie, sluit de zijkanten van de incisie met hechtingen. Plaats een stuk PBS doordrenkt katoen op de top van het orgaan om het vochtig te houden. Plaats het verwarmingselement bovenop het dier houder fase (figuur 2A). Zet het dier bovenop het verwarmingselement in het dier houder orgaan tot (Figuur 2B). Knijp het orgel aan beide zijden met een klem made van dunne aluminiumfolie (figuur 2C). Sluit het dier houder en plaats het verwarmingselement bovenaan probe zo dicht mogelijk om weefsel (Figuur 2D). Deze verwarming probe meet continu de temperatuur orgaan en stuurt deze informatie naar de verwarmer de elektrische stroom aan te passen, hem bij 37 ° C. Verwijder de PBS doordrenkte katoen en voeg laagsmeltende agarose (2% in PBS) bij 30 ° C bovenop de voorbereiding. Bedek de hele voorbereiding met de bovenste verwarmingselement (figuur 2E). In de opening aan deze kachel is een dekglaasje isoleren van de agarose uit het doel (figuur 2F). Toezicht houden op de muis anesthesie en injecteer een halve dosis te verhogen om de 40 minuten. Nadat het beeld acquisitie, euthanaseren het dier met CO 2. OPMERKING: Foto's van de aluminiumfolie clip en boven verwarmingselement weergegeven in figuur 3. 3. Twee-foton beeldvorming acquisitie We gebruikten een rechtopstaande "Prairie Ultima XY" twee-foton microscoop. Ons systeem is voorzien van een Ti: saffier laser, vier top PMTs voor gelijktijdig tot 4 kanalen acquisities en 20x water immersie objectief. Zet de Ti: saffier laser en het hele systeem microscoop. Voeg dichroïsche spiegels en filter sets afhankelijk van het gewenste golflengten. In ons geval gebruikten we een Olympus-BX2 Chroma houder met een 565 nm dichroïsche spiegel, een 525/50 nm filter (Foxp3-GFP signaal) en een 595/50 nm filter (Dextran-Rhodamine B-signaal in bloedvaten ). De gebruikte laser was golflengtegebied tussen 880 en 900 nm. Voeg het dier houder aan de microscoop, sluit aan en schakel alle kachels, voeg water toe aan de bovenkant kachel diafragma, kantel de doelstelling in het water, en zich richten op een schip of een GFP-Tregs. Met de microscoop x, y, z externe controle snel overzicht het weefsel naar een gebied lokaliseren van belang. Stel de gain van de PMTs kleurscheiding optimaliseren en minimaliseren de hoeveelheid laser moet voldoende signaal over achtergrond te bereiken. Probeer de minimale hoeveelheid van de laser te gebruiken om foto-schade aan uw weefsel te voorkomen. Zodra het gebied van belangen is gelegen, te beginnen time-lapse imaging. In ons geval een typische 5D (x, y, z, t, en kleur) verwerving protocol bestaat uit het verwerven opeenvolgende beelden van een 50 urn diepte weefselvolume, verdeeld in 4,0 urn z-stappen, x en y lengte van 140 urn elk. Elk volume duurt ongeveer 30 seconden aan te schaffen. Daarom wordt 60 acquisities uit te voeren ongeveer 30 min van het beeld overname. Breng de gegevens naar de institutionele server en gebruiken ImageJ, Imaris of Volocity software om multi-dimensionale weergave en cell tracking uit te voeren. 4. Representatieve resultaten g1.jpg "/> Figuur 1. . Embryonale thymus aanvaarding en functie Na BM recover werden embryonale thymussen getransplanteerd BM gereconstitueerde dieren twee weken na transplantatie thymus, deze muizen werden eenmaal per week bloedde de percentages van T cel subtypes controleren door kleuring met anti-CD4 of anti-CD8 MAbs. We beschouwden de thymus succesvol aanvaard dieren met een CD4: CD8 in verhouding 1.5-2.0:1 (A). Om de functionaliteit te bevestigen, wat we opgeofferd thymus-en getransplanteerde dieren vergeleken percentage van verschillende subpopulaties thymocyt met WT-muizen (B). De percentages van dubbel negatieve (DN; CD4 – CD8 – thymocyten) subpopulaties (door kleuring met anti-CD25 en anti-CD44 MAbs), dubbel positieve (DP; CD4 + CD8 + thymocyten) en single-positieve (SP) CD4 + of CD8 + thymocyten waren vergelijkbaar tussen deze dieren. ig2.jpg "/> Figuur 2. Animal houdermontage. Na diep verdoofd het dier bovenop een verwarmingselement, eerder boven op het dier houder fase (A). De nier met de getransplanteerde thymus naar boven (B). Een aluminium folie klem knijpt zachtjes de hele nier (C) te houden op zijn plaats. Fig. 1C inzet toont in detail de klem. Het bovenste deel van het dier houder wordt opgezet (D). De PBS gedrenkte katoen uit de top van het orgaan, vervangen door warme laag-smeltende agarose en de bovenste verwarmer toegevoegd (E). Tenslotte wordt het geheel naar de microscoop, hier vertegenwoordigd door de doelstelling (F). Figuur 3. Details van de houder onderdelen. Deze foto's laten de aluminium folie klem (A) die de nier (B). Let ook op de regio waar de getransplanteerde thymus bevindt. Dit geeft ongeveer regionaar de thymus capsule snijden en maken de zak om de embryonale thymus te zetten. De bovenste verwarmer dekglaasje (C) werd gefixeerd met siliconenlijm naar zijn onderste deel (D). Film 1. Intravitale beeldvorming van Foxp3-GFP + thymocyten in de thymus waar de fysiologische niveaus van zuurstof en temperatuur (37 ° C) zijn tijdens het gehele proces. Let op de doorbloeding en de beweging van Tregs. Deze snelheden kunnen worden gemeten en vergeleken met gepubliceerde gegevens. Klik hier om de film te bekijken. Movie 2. Intravitale beeldvorming van Tregs in een thymus waar de beelden werden verkregen bij 30 ° C. Let op de afwezigheid van beweging en de ronde vorm van de cellen, ondanks het onderhoud van de bloedstroom. Klik hier om de film te bekijken.