רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב
Summary
זיהוי Immunocytochemical של הפריפריה תת סיב עצב תחושתי (גילוי של ביטוי החלבון בו) הם המפתח להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תחושה היקפית. כאן אנו מתארים שיטות להכנת דגימות רקמה היקפי / הקרביים, כגון עצמות עור הגפיים, immunostaining מסוים של סיבי עצב היקפי חושית.
Abstract
איתור ועיבוד ראשוני של חומר כימי, פיזי גירויים חושיים תרמי ההיקפיים על ידי סיבי עצב תחושתי היא המפתח תפיסה חושית בבעלי חיים ובבני אדם. אלה סיבי העצבים התחושתיים ההיקפיים להביע שפע של קולטנים ערוץ חלבונים יון אשר לזהות ליזום גירויים חושיים ספציפיים. שיטות זמינים כדי לאפיין את התכונות החשמליות של סיבי עצב היקפי חושי innervating את העור, אשר יכול גם להיות מנוצל כדי לזהות את הביטוי הפונקציונלי של חלבונים ספציפיים ערוץ יון בסיבים אלה. עם זאת, שיטות אלקטרו דומים אינם זמינים (והם גם קשה לפתח) לצורך זיהוי של הביטוי הפונקציונלי של קולטנים וחלבונים ערוץ יון בשנת היקפי סיבי עצב תחושתי innervating אברי בטן אחרים, כולל הרקמות המאתגרים ביותר, כגון עצם. יתר על כן, שיטות אלקטרו כזה לא יכול להיות מנוצל על מנת לקבוע את הביטוי של החלבון לא להתרגשים של הפריפריה סיבי עצב תחושתי. לכן, immunostaining של דגימות רקמה היקפי / הקרביים עבור חמישיות העצבים התחושתיים מספק את הדרך הטובה ביותר ניתן לקבוע את הביטוי של חלבונים ספציפיים של עניין אלה סיבי העצב. עד כה, רוב המחקרים ביטוי החלבון עצב סנסורי להיות מנוצל immunostaining ההליכים בגרעיני חושי, שבו מידע מוגבל הביטוי של חלבונים מסוימים בגוף התא של סוגים מסוימים או תת נוירונים חושיים. כאן אנו מדווחים שיטות מפורט / פרוטוקולים להכנת דגימות רקמה היקפי / הקרביים עבור immunostaining של סיבי עצב היקפי חושית. אנחנו במיוחד שיטות פרט להכנת העור או ביופסיה plantar אגרוף העצם (עצם הירך) סעיפים מעכברים עבור immunostaining של סיבי עצב היקפי חושית. שיטות אלה לא רק מפתח להגדרה האיכותי של ביטוי החלבון עצב סנסורי הפריפריה, אלא גם לספק שיטה assay כמותיקביעת שינויים בביטוי רמות החלבון או תת סוגים מסוימים של סיבים חושית, כמו גם לקביעת שינויים מורפולוגיים ו / או אנטומי במספר וצפיפות הסיבים החושית במהלך מצבים פתולוגיים שונים. יתר על כן, שיטות אלה אינם מוגבלים רק כתמים של סיבי עצב תחושתי, אבל יכול לשמש גם עבור צביעת כל סוגי סיבי עצב בעור, עצמות ורקמות הקרביים אחרים.
Protocol
Discussion
כאן יש לנו את השיטות מפורט להכנת העור העכבר רקמת העצם חלקים עבור immunostaining וזיהוי של סיבי עצב היקפי חושית. הסעיפים המופק plantar ביופסיות אגרוף להכיל העור glabrous ושעיר, כלומר פרוטוקול ניתן להשתמש על כל סוג העור. טכניקות אלה יכולים גם להיות מועסק להכתים סוגי תאים אחרים ברקמות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר יורי מ Usachev על עזרתו סטנדרטיזציה הראשונית של מיקרוסקופיה confocal / הדמיה של עכבר plantar immunostaining ביופסיה; וד"ר דונה ל המונד לעזרה המשיך אותה ביקורת בונה בעבודה זו. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של NINDS / NIH (NS069898), ואת פיתוח רעיון הענקת פרס מהמחלקה תוכנית הביטחון מחקרים סרטן הערמונית (DoD-PCRP-101096) כדי DPM
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue No. | Comment |
| 3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella | 15094 | |
| Perfusion pump | Material | VWR International | 23609-170 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
| Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
| OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
| Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | RPI Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) |
|
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella | 11859 | |
| Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
- Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
- Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
- Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
- Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
- Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
- Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
- Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
- Persson, A. -. K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
- Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
- Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).
