Neurodegenerative रोगों में उच्च सामग्री स्क्रीनिंग
Summary
हम एक उच्च सामग्री इमेजिंग के साथ स्वचालित संवर्धन सेल के संयोजन के लिए कल्पना और एक उच्च throughput ढंग में कई सेलुलर प्रक्रियाओं और संरचनाओं यों, पद्धति का वर्णन. इस तरह के तरीकों जीनोम के आगे कार्यात्मक एनोटेशन में सहायता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोग जीन नेटवर्क और संभावित दवा लक्ष्य की पहचान कर सकते हैं.
Abstract
The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary ‘omics’ approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson’s Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long.
There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS.
HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a ‘phenomics’ scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility.
Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21.
Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.
Protocol
Discussion
/ एचटी कोर्ट सेलुलर स्क्रीनिंग सिस्टम की कम लागत, शक्तिशाली जीनोम चौड़ा जीन समारोह को संशोधित करने के उपकरण की उपलब्धता के साथ संयुक्त के साथ, हिंदुस्तान टाइम्स / कोर्ट स्क्रीन शिक्षा में आम होते जा रहे हैं. दृष्टिकोण पहले से ही सफलतापूर्वक किया गया है 9 कैंसर, 31-33 और भ्रूण विकास 34-36 में दवा लक्ष्य की पहचान के रूप में इस तरह के अनुसंधान के विविध क्षेत्रों के लिए लागू किया और यहां तक कि neuropsychiatric 37,38 विकारों में शामिल रास्ते में गूढ़ रहस्य में आवेदन के लिए क्षमता है. लेकिन एक ऐसी प्रणाली के कार्यान्वयन के समय और अनुकूलन प्रक्रिया के साथ प्रयास अक्सर 6 महीने की एक न्यूनतम ले का एक महत्वपूर्ण निवेश की आवश्यकता है. Trypsinization बार, pipetting गति और बोने घनत्व के रूप में सभी कदम, समायोजित किया जा करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को स्वस्थ हैं और लगातार बढ़ने. बैक्टीरियल संदूषण की रोकथाम एक सबसे कठिन चुनौतियों का सामना ग में साप्ताहिक सफाई प्रोटोकॉल के साथ स्वचालित सेल संस्कृति में से एक हैलगातार 70% इथेनॉल संदूषण मुक्त संस्कृतियों के लिए आवश्यक होने के साथ सभी तरल असर लाइनों के rinsing के साथ ombination. यह भी होना आवश्यक करने के लिए रोबोटिक्स में सुधार होगा ताकि उच्च संकल्प और -80 ° यौगिक भंडारण के लिए C फ्रीजर एकीकृत किया जा सकता है के लिए confocal सूक्ष्मदर्शी के रूप में अतिरिक्त उपकरणों,.
वहाँ भी सीमाएं हैं कि संवेदनशील, और इस जीन नेटवर्क का अध्ययन और विधि रोगजनक आणविक रास्ते में शामिल जीनों की पहचान की गति उपयोगिता में सुधार करने के लिए संबोधित किया जाना चाहिए.
एक स्क्रीन / एचटी कोर्ट का संचालन करने के लिए और सुनिश्चित करें कि विश्वसनीय डेटा एकत्र है, कई पहलुओं को अनुकूलित किया जाना है. पहला, माप की विश्वसनीयता सर्वोपरि है और मजबूती और परख की संवेदनशीलता पर निर्भर है. उदाहरण के लिए, ऊपर वर्णित assays के छोटे परदे के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन संख्या प्रसंस्करण छवि अधिग्रहण से पहले आवश्यक कदम की वजह से एक जीनोम व्यापक पैमाने पर लागू करने के लिए मुश्किल हैं.इस प्रकार, एक स्थिर सेल लाइनों का निर्माण रिपोर्टर जीन है, जो प्रत्यक्ष इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं और कमी आई भिन्नता प्रसंस्करण कदम की कम संख्या के कारण के लिए नेतृत्व करेंगे व्यक्त होता है. वर्तमान में, डिजाइन एक परख है कि सही ढंग से दर्शाया गया है और मज़बूती quantifies ब्याज की एक phenotype कोर्ट स्क्रीनिंग प्रक्रिया में एक बड़ी अड़चन है.
कई स्क्रीन स्तनधारी अलग आरएनएआई पुस्तकालयों, जो सभी के बंद लक्ष्य प्रभाव सीमित जीन मुंह बंद दक्षता और अधूरा जीनोम कवरेज से पीड़ित का उपयोग कोशिकाओं में आयोजित की जाती हैं. इस प्रकार पुस्तकालयों के लिए बनाया जा जो अधिक विशिष्ट, शक्तिशाली हैं और बेहतर कवरेज की जरूरत है. बनाने के प्रयास चल रहे हैं ऐसे यह आशा की जाती है ऐसे प्रयासों एचटी / कोर्ट scre के reproducibility में सुधार होगा एन हिट.
कई बड़े पैमाने पर सेल आधारित स्क्रीन की एक सीमा है कि वे neuroblastoma कोशिकाओं में आयोजित कर रहे हैं क्योंकि वे आनुवंशिक हो सकता है और चालाकी रिश्तेदार आसानी के साथ कर सकते हैं बड़ी संख्या के लिए सुसंस्कृत. हालांकि, 'हिट' vivo समारोह में पूर्व vivo सेल संस्कृति मॉडल में पहचान की प्रासंगिकता संदिग्ध है, खासकर के रूप में मस्तिष्क अति विशिष्ट कक्ष प्रकार है कि एक घने और जटिल synaptic कनेक्शन के एक उच्च एकीकृत इकाई के रूप में कार्य करने के लिए नेटवर्क के रूप में होते हैं. एक परिणाम के रूप में, यह आम है कि हिट की पहचान स्क्रीनिंग ऊपर वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर, माध्यमिक अतिरिक्त तकनीक का उपयोग कर स्क्रीन में और अधिक शारीरिक प्रासंगिक 39 मॉडल में मान्य हैं. HCS के दौरान पहचान हिट के अनुवाद में सुधार करने के लिए, प्राथमिक कोशिकाओं और विभेदित स्टेम कोशिकाओं या सह संस्कृति प्रणालियों जैसे अधिक प्रतिनिधि और परिष्कृत मॉडल, विकसित और हिंदुस्तान टाइम्स / कोर्ट दृष्टिकोण के लिए अनुकूलित की जरूरत है.
ntent स्वचालित संवर्धन सेल और कोर्ट एक इमेजिंग का एक संयोजन के साथ "> तेजी से कैसे न्यूरॉन्स के समारोह में नए अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकते हैं और निर्धारित रास्ते जो रोग के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं अन्य omics 'के दृष्टिकोण से उत्पन्न जानकारी के साथ HCS / HTS डेटा संयोजन. तब संभव हो सकता है मस्तिष्क रोगों का एक सिस्टम जीवविज्ञान सिंहावलोकन का निर्माण, इस प्रकार चिकित्सकीय विकास की सुविधा.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जारी रखने और तकनीकी सहायता के लिए समर्थन ईवा Blaas के लिए हैमिल्टन प्रोग्रामर और विशेषज्ञों को धन्यवाद. T5 207: एसजे तिवारी फार्मा द्वारा समर्थित है, यह काम दो NWO निवेश अनुदान, (911-07-031 और 40-00506-98-10011) Prinses बीट्रिक्स Fonds 2009 Wetenschapsprijs और तंत्रिका विज्ञान कैम्पस एम्स्टर्डम के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number |
| AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
| OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
| RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
| OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
| 96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
| DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
| BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
| MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
| HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
| HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
| TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
| DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
| PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
| SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
| CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |
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