הקרנת תוכן גבוהה במחלות ניווניות
Summary
אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת culturing תא אוטומטי עם דימות גבוהה תוכן כדי לחזות ולכמת תהליכים תאיים רבים ומבנים, באופן תפוקה גבוהה. שיטות כאלה יכולות לסייע ביאור תפקודית נוספת של הגנום, כמו גם לזהות את הגן למחלה רשתות מטרות סמים פוטנציאליים.
Abstract
The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary ‘omics’ approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson’s Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long.
There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS.
HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a ‘phenomics’ scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility.
Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21.
Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.
Protocol
Discussion
עם הפחתת עלויות של HT / HC מערכות הסלולר ההקרנה, בשילוב עם הזמינות של הגנום כולו כלים חזקים כדי לשנות את תפקוד הגן, HT / HC המסכים הופכים דבר שבשגרה באקדמיה. הגישה כבר הותקן בהצלחה בתחומים מגוונים של מחקר כגון זיהוי של מטרות התרופה לסרטן 9, 31-33 ו – 34-36 התפתחות עוברית ואפילו יש פוטנציאל ליישום בפענוח המסלולים המעורבים הפרעות נוירופסיכיאטריות 37,38. עם זאת יישום של מערכת כזו דורשת השקעה משמעותית של זמן ומאמץ עם אופטימיזציה של תהליך לעתים קרובות לקחת מינימום של 6 חודשים. כל השלבים, כמו פעמים trypsinization, מהירויות pipetting וצפיפות זריעת צריך להיות מותאם, על מנת להבטיח כי תאים בריאים לצמוח בעקביות. מניעת זיהום חיידקי הוא אחד האתגרים הקשים ביותר מול תרבית תאים אוטומטית עם פרוטוקולי ניקוי שבועי גombination עם שטיפה מתמדת של כל הקווים נושאות נוזל עם 70% אתנול להיות הכרחי תרבויות זיהום בחינם. זה יהיה גם צורך לשפר את הרובוטיקה, כך מכשירים נוספים, כגון מיקרוסקופים confocal עבור רזולוציה גבוהה יותר ו -80 ° C מקפיאים לאחסון המתחם יכול להיות משולב.
יש גם מגבלות צורך לטפל על מנת לשפר את מהירות רגיש, השירות של שיטה זו ללמוד רשתות גנים ולזהות גנים המעורבים מסלולים מולקולריים פתוגניים.
כדי לנהל מסך HT / HC ולהבטיח כי נתונים אמינים נאסף, כמה היבטים צריך להיות מותאם. ראשית, אמינות המדידה היא מעל לכל תלוי חוסנו ואת הרגישות של assay. למשל, מבחני המתוארים לעיל מתאימים המסכים קטנים יותר, אבל קשה ליישם בקנה מידה רחב הגנום, בשל עיבוד מספר צעדים נדרשים לפני רכישת התמונה.לפיכך, אפשר היה לבנות שורות תאים יציבות לבטא את הגן הכתב, אשר יאפשר הדמיה ישירה להוביל וריאציה ירד בשל מספר מופחת של מדרגות עיבוד. נכון לעכשיו, תכנון assay מתאר במדויק ובאמינות מכמת פנוטיפ של עניין הוא צוואר הבקבוק העיקרי בתהליך המיון HC.
מסכי רבים שנערכו בתאי יונקים שונים באמצעות ספריות RNAi, אשר כולם סובלים מחוץ יעד אפקטים, יעילות מוגבלת להשתקת גנים בגנום כיסוי שלם. לפיכך ספריות צריך להתבצע אשר הם ספציפיים יותר, חזק ויש לי כיסוי טוב יותר. נערכים מאמצים ליצור כזה הוא קיווה במאמצים כזה ישפר את שחזור של HT / HC scre en להיטים.
הגבלה של רבים בקנה מידה גדול תא מסכי מבוססות כי הם נערכים בתאי נוירובלסטומה כי הם יכולים להיות מניפולציות גנטיות ותרבותי על מספרים גדולים בקלות יחסית. עם זאת, את הרלוונטיות של "להיטים" מזוהה לשעבר התרבות מודלים vivo תא בתפקוד vivo מוטלת בספק, במיוחד כאשר המוח מורכב של סוגי תאים מאוד מיוחדים אשר יוצרים רשת צפופה ומסובכת של קשרים סינפטיים לתפקד כיחידה משולבת מאוד. כתוצאה מכך, מקובל שפוגע מזוהה באמצעות גישה ההקרנה שתוארו לעיל, הן תוקף משני מסכי שימוש בטכניקות נוספות של מודלים רלוונטיים יותר פיזיולוגיים 39. כדי לשפר את בתרגום של להיטים המזוהים במהלך HCS, נציג מודלים מתוחכמים יותר, כגון תאים ראשוניים התמיינות בתאי גזע או תרבות משותפת מערכות צריך להיות מפותחות המותאמות HT / HC גישות.
"ntent> עם שילוב של culturing תא אוטומטיות HC הדמיה אחד יכול במהירות לקבל תובנות חדשות על איך הנוירונים פונקציה ולקבוע אילו מסלולים חשובים להתפתחות המחלה. שילוב HCS / HTS נתונים עם מידע המופק גישות אחרות" omics ', זה יהיה אז ניתן יהיה לבנות סקירה מערכות הביולוגיה של מחלות במוח, ובכך להקל על התפתחות טיפולית.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים המילטון מתכנתים ומומחי תמיכה מתמשכת Blaas אווה לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי שני מענקים NWO השקעה (911-07-031 ו 40-00506-98-10011), ביאטריקס Prinses Fonds Wetenschapsprijs 2009 ואת קמפוס Neuroscience אמסטרדם; ש"י נתמך על ידי TI-פארמה: T5-207.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number |
| AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
| OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
| RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
| OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
| 96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
| DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
| BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
| MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
| HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
| HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
| TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
| DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
| PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
| SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
| CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |
References
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461, 908-915 (2009).
- Ge, H., Walhout, A. J., Vidal, M. Integrating ‘omic’ information: a bridge between genomics and systems biology. Trends. Genet. 19, 551-560 (2003).
- Zhu, H., Snyder, M. ‘Omic’ approaches for unraveling signaling networks. Curr. Opin. Cell. Biol. 14, 173-179 (2002).
- Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68, 207-217 (2010).
- Manolio, T. A. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature. 461, 747-753 (2009).
- Nalls, M. A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson’s disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377, 641-649 (2011).
- Simon-Sanchez, J. Genome-wide association study confirms extant PD risk loci among the Dutch. Eur. J. Hum. Genet. 19 (6), 655-661 (2011).
- Van Regenmortel, M. H. Reductionism and complexity in molecular biology. Scientists now have the tools to unravel biological and overcome the limitations of reductionism. EMBO. Rep. 5, 1016-1020 (2004).
- Aherne, G. W., McDonald, E., Workman, P. Finding the needle in the haystack: why high-throughput screening is good for your health. Breast. Cancer. Res. 4, 148-154 (2002).
- An, W. F., Tolliday, N. J. Introduction: cell-based assays for high-throughput screening. Methods. Mol. Biol. 486, 1-12 (2009).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 580-588 (2009).
- Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445-451 (2000).
- Conrad, C., Gerlich, D. W. Automated microscopy for high-content RNAi screening. J. Cell. Biol. 188, 453-461 (2010).
- Thomas, N. High-content screening: a decade of evolution. J. Biomol. Screen. 15, 1-9 (2010).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3840-3845 (2005).
- Dragunow, M. High-content analysis in neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 9, 779-788 (2008).
- Varma, H., Lo, D. C., Stockwell, B. R. High throughput screening for neurodegeneration and complex disease phenotypes. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 238-248 (2008).
- Durr, O. Robust hit identification by quality assurance and multivariate data analysis of a high-content, cell-based assay. J. Biomol. Screen. 12, 1042-1049 (2007).
- Miller, J. Quantitative relationships between huntingtin levels, polyglutamine length, inclusion body formation, and neuronal death provide novel insight into huntington’s disease molecular pathogenesis. J. Neurosci. 30, 10541-10550 (2010).
- Jain, S., Sondervan, D., Rizzu, P., Bochdanovits, Z., Caminada, D., Heutink, P. The Complete Automation of Cell Culture. Journal of Biomolecular Screening. 16 (8), (2011).
- Bonifati, V. Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism. Science. 299, 256-259 (2003).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (16), e755-e755 (2008).
- Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
- Moffat, J. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124, 1283-1298 (2006).
- Volksgezondheid, M. V. Integrale versie van de Regeling genetisch gemodificeerde organismen en het Besluit genetische gemodificeerde. Organismen. , (2004).
- Anderl, J. L., Redpath, S., Ball, A. J. A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (27), e1173-e1173 (2009).
- Wiles, A. M., Ravi, D., Bhavani, S., Bishop, A. J. An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme. J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).
- Canet-Aviles, R. M. The Parkinson’s disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).
- Blackinton, J. Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1. J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).
- Gupta, P. B. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138, 645-659 (2009).
- Luo, J. A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene. Cell. 137, 835-848 (2009).
- Mouchet, E. H., Simpson, P. B. High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges. IDrugs. 11, 422-427 (2008).
- Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).
- Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).
- Ross, P. J., Ellis, J. Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells. F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).
- Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).
