قياس الكالسيوم عصاري خلوي 2 + في مفاوية مقلص متفرقة
Summary
نقدم هذا النهج لتقييم كا عصاري خلوي<sup> 2 +</sup> التركيز في مفاوية معزولة لدراسة كاليفورنيا<sup> 2 +</sup> والتي تعتمد على الكالسيوم<sup> 2 +</sup> آليات للتوعية من تقلص العضلات الملساء اللمفاوي.
Abstract
الأوعية اللمفاوية تشمل نظام نقل متعدد الوظائف التي تحافظ على توازن السوائل والدهون يسلم إلى الدورة الدموية المركزية ، ويعمل بمثابة نظام للمراقبة لمستضدات يمكن أن تكون ضارة ، وتحسين مناعة الغشاء المخاطي والاستجابات المناعية التكيفية 1. يتكون من السائل الخلالي الليمفاوية الذي يدخل الأعمى العضوية مفاوية الأولية ، ومن ثم يتم نقلها ضد التدرج في جو من الضغط وجمع الأوعية اللمفاوية. يتم جمع كل اللمفاوي يتكون من سلسلة من شرائح تسمى lymphangions ، مفصولة ضاحكة الصمامات التي تمنع ارتجاعي. كل lymphangion تمتلك دورة مقلص الليمفاوية الذي يدفع مقابل الضغط التدرج نحو تعميم المركزية 2. هذا النمط طوري مقلص مشابه لدورة القلب ، والانقباضي والانبساطي مراحل ، ومع 4 الانكماش أدنى تردد بالإضافة إلى ذلك ، على نحو سلس العضلات اللمفاوية يولد نغمة ويعرض انقباض عضلي وتمدد طن ردا على الزيادة والنقصان في ضغط اللمعية ، على التوالي 5. ويقترح بالتالي مزيج من الآليات الجزيئية التي تدعم كلا من انقباض طورية ومنشط لمفاوية.
وينظم عموما تقلص العضلات الملساء التي كا 2 + تركيز عصاري خلوي ([كا 2 +] I) ، بالإضافة إلى الحساسية للكا 2 + ، من العناصر مقلص في استجابة للتغيرات في البيئة المحيطة الخلية 6. [كا 2 +] ط يتحدد من قبل مجموعة من حركة كا 2 + يجند من خلال غشاء البلازما أو الجهد بوابات الكالسيوم 2 + قنوات والإفراج وامتصاص الكالسيوم 2 + من مخازن الداخلية. عصاري خلوي كا 2 + بربط كالمودولين وينشط الإنزيمات مثل ضوء سلسلة الميوسين (حركة تحرير الكونغو) كيناز (MLCK) ، والذي بدوره يؤدي إلى حركة تحرير الكونغو phosphorylates الأكتين ، الميوسين بوساطة انكماش 8. ومع ذلك ، فإن حساسية هذا الممر الى كاليفورنيا <supيمكن تنظيم> 2 + من قبل حركة تحرير الكونغو الفوسفاتيز (MLCP) 9. وينظم MLCP النشاط كيناز رو (روك) ومثبط الفوسفاتيز الميوسين بروتين CPI – 17.
هنا ، نقدم طريقة لتقييم التغيرات في [كا 2 +] أنا مع مرور الوقت في الأوعية اللمفاوية ، معزولة perfused من أجل دراسة كا 2 + والتي تعتمد على الكالسيوم 2 + للتوعية آليات اللمفاوية تقلص العضلات الملساء. استخدام الفئران المعزولة مفاوية المساريقي جمع درسنا تمتد بفعل التغيرات في [كا 2 +] ط مقلص والنشاط. نموذج اللمفاوية معزولة يوفر ميزة أنه يمكن الضغط والتدفق ، والتركيب الكيميائي للحمام حل لرقابة مشددة. [كا 2 +] كنت مصممة عن طريق تحميل مفاوية مع ratiometric ، كا 2 + ملزم صبغ Fura – 2. وستوفر هذه الدراسات نهجا جديدا لمشكلة أوسع نطاقا لدراسة مختلف الآليات الجزيئية التي تنظم طوريمقابل انكماش انقباض العضلات في منشط اللمفاوي على نحو سلس.
Protocol
Discussion
كان يعمل الرواية مزيج من الأساليب لدراسة جوهرية ضخ الأوعية اللمفاوية. القدرة على قياس التغيرات في وقت واحد [كا 2 +] وأنا وقطر في مفاوية ضخ تسمح للدراسات للمساهمات النسبية للكا 2 + والتي تعتمد على الكالسيوم 2 + للتوعية مسارات إشارات في الآلية الشام…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| 1. Ringer 5x Stock | |||
| Company | Catalog Number | Amount | |
| Sodium Chloride | EMD | SX0420-3 | 35 g |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040 | 1.75 g |
| Calcium Chloride | Sigma | C-3881 | 1.47 g |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M-9397 | 1.44 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C | |||
| 2. MOPS buffer | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| MOPS | Sigma | M3183 | 125.6 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C | |||
| 3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS) | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| Ringer stock (5x) | N/A | N/A | 200 mL |
| Mops Buffer | N/A | N/A | 5 mL |
| Sodium Phosphate | Sigma | S-9638 | 0.168 g |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | 0.22 g |
| EDTA sodium salt | Sigma | ED2SS | 0.0074 g |
| Glucose | Sigma | G7528 | 0.901 g |
| Albumin, Bovine | USB | 10856 | 10 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C. |
Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.
References
- Chakraborty, S. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, 94-94 (2010).
- Zawieja, D. Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future. Microcirculation. 12, 141-141 (2005).
- Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress. Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).
- Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).
- Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).
- Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells. Nature. 280, 506-506 (1979).
- Wang, W. Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).
- Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).
- Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase. Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).
- Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication. Microcirculation. 17, 514-514 (2010).
- Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism. Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).
- Shirasawa, Y., Benoit, J. N. Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).
- Imtiaz, M. S. Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization. Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).
- Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation. Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).
- Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent. 286, H2287-H2287 (2004).
