1. Microchip de fabrication SU8 fabrication de maître. Pour obtenir des canaux microfluidiques hauteur de 40 um, manteau tour SU8-50 (MicroChem Corp) sur une plaquette de silicium à 3000 rpm pendant 30 s. Cuire au four doux sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 5 minutes et 95 ° C pendant 30 minutes pour évaporer le solvant et de densifier le film. Après refroidissement, exposez le SU8 résister avec 360 à 440 nm à 300 radiations mJ / 2 sous le masque approprié. Après une exposition, faire cuire la galette à 65 ° C pendant 2 minutes et 95 ° C pendant 4 minutes. Après refroidissement, développer les zones non exposées (CE Micrpoposit solvant, Chestech) pendant 5 minutes, en remuant. 5 Utilisez solvant frais pour se rincer la plaquette et ensuite sécher sous gaz pour produire une surface propre CE. Traiter la plaquette avec des lavages de l'hexane et le méthanol. Terminez le processus de fabrication SU8 maître avec une étape finale de s'évaporer trichloro (1,1,2,2-perfluoocytl) silane sur la surface (dans un dessiccateur pendant 40 minutes). PDMS Curing, découpe et de perforation. Pour former des substrats structurés microfluidique, nous mélangeons Sylgard 184 (Dow Corning) en 10:1 (p / p) rapport de la résine de réticulant et ensuite verser sur le maître. Degas dans un dessiccateur, puis la guérison de l'appareil (couche supérieure) pendant une heure à 65 ° C. Couper le guérir PDMS et le retirer du maître. Créer des trous d'accès pour les tubes de fluides utilisant une biopsie. Cure autre couche de PDMS (8 g de la résine uniformément réparties dans un plat 10×10 cm Petri) pendant 20 minutes à 65 ° C. Placez la couche supérieure préparées sur la couche inférieure et ensuite sécher durant la nuit à 65 ° C. Peler les jetons de la boîte de Pétri et les dés pour les utiliser. 2. Montage expérimental Configuration microfluidiques Remplir les seringues (en plastique ou en verre de Beckton, Dickinson and Company ou de SGE Analytical Science) avec les solutions nécessaires, en s'assurant qu'aucune bulle d'air restent dans toutes les parties de la tuyauterie. Pour la génération de gouttelettes deux phases sont utilisées. La phase aqueuse (dispersion) des PVVIHe contient les réactifs d'intérêt (par exemple une suspension de cellules dans un milieu de croissance, ou une solution de fluorophores moléculaire). La phase huileuse, qui agit dans ce cas que la phase continue, est généralement constitué d'un mélange d'huile et de tensio-actif, par exemple tensioactif Raindance 2% (RainDance Technologies) dans de l'huile fluorée (3M Fluorinert liquide électronique CF-40), ou 2% Span 80 (Croda) dans l'huile minérale. Fit tube (tubes en polyéthylène, Harvard Apparatus) de même diamètre interne que les pointes d'aiguille seringue sur un bout à l'aiguille. Le tube doit être coupé à la longueur la plus courte possible pour minimiser les instabilités d'écoulement dus à des perturbations vibratoires. Connectez l'autre extrémité du tube directement dans les trous percés dans le substrat de PDMS. Des solutions plus complexes, telles que l'utilisation des ports capillaire de silice ou de connecteurs (par exemple Nanoports Upchurch) peuvent également être mises en œuvre pour une interface plus robuste entre le dispositif microfluidique et la tubulure. Raccordez la sortieport de la puce pour les tubes et directe dans un collecteur (pour la collecte des déchets ou le traitement analyte plus loin). Montez les seringues sur une pompe à seringue (par exemple pompes PHD 4400 HPSI seringue programmable, Harvard Apparatus) et de définir les infusant débit désiré pour chaque phase (généralement de l'ordre de microlitres par minute). Un ratio minimum d'huile / aqueuse des débits de 1 est recommandé d'éviter le mouillage du PDMS par la phase aqueuse, ce qui conduirait à la formation de gouttelettes instable (selon la géométrie de périphérique). Pour la même raison, il est également recommandé de commencer par rincer la phase huile seule, à travers tous les canaux microfluidiques, avant l'introduction de la phase aqueuse. La configuration finale utilisée pour le présent des expériences est illustrée à la figure 2a. Configuration du système optique Pour la sonde de petits volumes (jusqu'à un picolitre quelques-uns) dans les canaux microfluidiques avec une résolution spatiale et temporelle élevée utiliser un microscope confocal (avec automatela capacité de positionnement submicronique éd.) Utilisez soluble dans l'eau des molécules fluorescentes, avec des rendements quantiques parfaitement élevé. Exciter les molécules en utilisant un laser fonctionnant à une longueur d'onde qui correspond à l'absorption du fluorophore impliqués. Par exemple, commune molécules fluorescentes telles que la fluorescéine 5-isothiocyanate (FITC) et Alexa-Fluor 488 peut être efficacement excité à l'aide d'un laser diode 488 nm (par exemple PicoQuant Gmbh, la LDH-PC-485). Molécules fluorescentes, comme le Texas Red ou allophycocyanine (APC) peut être efficacement sorti à 633 nm en utilisant un laser He / Ne (ex R-31425 Newport). Utilisez des lasers pulsés exploitation, à taux de répétition de plusieurs MHz (avec plusieurs séparations impulsions ns) et fluorophores ayant des propriétés durée suffisamment différenciés pour l'imagerie de vie de fluorescence (FLIM) expériences. Utilisez faisceau de direction miroirs et des optiques pour contrôler la hauteur du faisceau ainsi que la direction du faisceau. Utilisez un miroir dichroïque pour refléter le faisceau laser dans l'objectif Lens. Si deux lasers sont utilisés simultanément, miroir d'un bi-bande dichroïque peut être installé afin de permettre une réflexion sur les deux faisceaux laser (par exemple pour 488 et 633 nm poutres d'un miroir à partir z488/633rdc Technology Corporation Chroma est idéal). Utilisez une infinité corrigée, grande ouverture numérique (NA) objectif de microscope (c. Olympus 60 x / 1,2 NA, immersion dans l'eau) pour apporter la lumière laser à une concentration sans faille au sein d'un canal microfluidique. Lorsque vous travaillez avec des microcanaux de hauteur (> 100 um), l'objectif doit être utilisé judicieusement choisies afin de s'assurer que sa distance de travail couvre effectivement la pleine hauteur du microcanal. Recueillir fluorescence émise par l'échantillon (au sein du canal microfluidique) en utilisant le même objectif de haut NA et transmis par le même miroir dichroïque. Retirez toute la lumière d'excitation résiduelle en utilisant un simple ou double bande filtre d'émission (par exemple un filtre z488/633 de Chroma Technology Corporation). Axer la fluorescence emission sur un sténopé de 75 um en utilisant une lentille plan-convexe (par exemple 50,2 F; Newport Ltd.) Position du sténopé dans le plan confocale de l'objectif du microscope. Utilisez un autre miroir dichroïque (par exemple 630dcxr, Chroma Technology Corporation) pour diviser le signal fluorescent sur deux détecteurs. Filtre de la fluorescence réfléchie par le miroir dichroïque avec un filtre d'émission (par exemple une hq540/80 m filtre Chroma Technology Corporation) et de discussion avec une lentille plan-convexe (par exemple, f = 30,0, 25,4 mm id, Thorlabs) sur le premier ( «verte») du détecteur. Pour les expériences impliquant un fluorophore secondaires filtre rouge de la fluorescence transmise par le miroir dichroïque avec un autre filtre d'émission (par exemple un filtre hq640lp de Chroma Technology Corporation), puis discussion avec une autre lentille plan-convexe sur le second ("rouge") du détecteur. Utilisez photodiodes à avalanche (par exemple AQR-141, EG & G, Perkin-Elmer) pour la détection de photons de fluorescence. La configuration finale est illustré dans <strong> Figure 2b. 3. Génération de gouttelettes et d'acquisition de données Les méthodes de génération des gouttelettes Vous pouvez utiliser deux principales configurations de microcanaux à générer des gouttelettes: un flux de focalisation ou de format T-jonction (figure 3a et 3b) 6,7 Les deux méthodes sont équivalentes tant que les gouttelettes formées sont aussi larges que le microcanal lui-même.. En conséquence des forces de cisaillement qui découlent de l'utilisation de ces géométries à rapprocher les deux fluides non miscibles ensemble et les instabilités qui se développent suite capillaire dans l'interface, des gouttelettes monodisperses (aussi petit qu'un femtolitres quelques-uns) sont générés spontanément. Vous pouvez encapsuler des réactifs de différentes manières: les réactifs peuvent être préparées et mélangées hors puce pour le mélange souhaité / concentration, ou ils peuvent être amenés séparément dans la puce et ensuite combinés avant la formation de gouttelettes (figure 3C). Cettedernière méthode prévoit une plus grande flexibilité puisqu'il mélanges / concentrations peuvent être modifiées par un simple réglage des débits relatifs. Il est à noter que pour l'encapsulation de cellules, les cellules en suspension dans la seringue doit être agité pour éviter la condensation des cellules plus le calendrier de l'expérience. Fluorescence d'acquisition de données. Couple le signal électronique du détecteur photodiode à avalanche (décrit dans 2.2.12) à un périphérique DAQ multifonction pour l'enregistrement des données (par exemple une carte PCI 6602, National Instruments), fonctionnant sur un ordinateur personnel. Pour les expériences de FLIM connecter les détecteurs à un comptage de photons corrélés en temps simple (TCSPC) carte (par ex TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) fonctionnant sur un PC séparé. Cette carte permet aux données de vie de fluorescence d'être obtenu en utilisant une méthodologie TCSPC: chaque photon détecté fluorescente est corrélée à une impulsion laser incidente, et donc chaque photon émis fluorescentes se voit attribuer un temps de retard. Ces donnéespeut être équipé d'une courbe de décroissance mono ou multi-exponentielle pour obtenir une estimation du coefficient de fluorophore / s de taux radiatif / s. Déconvoluer les données brutes avec la fonction de réponse de l'instrument (IRF) du détecteur: ceci est obtenu en utilisant une faible concentration auramine-O solution (qui présente une durée de vie de fluorescence de quelques picosecondes) 8. 4. La reconnaissance cellulaire et de la cartographie de mélange au sein des gouttelettes La reconnaissance cellulaire et de la cartographie de mélange au sein des gouttelettes Utilisez Escherichia coli Top 10 souche de l'expérience test de viabilité. Culture des cellules dans le bouillon Luria-Bertani nuit et correspondre à la densité optique de 0,5 avant les expériences. Utiliser 0,4 uM SYTO9 et 1 iodure de propidium uM pour détecter la viabilité des cellules. Les deux sont d'ADN intercalant colorants et leur intensité de fluorescence augmente de plus de 20 plis lors de la liaison à l'ADN. SYTO9 est un colorant vert fluorescent qui membrane perméable et l'iodure de propidium est un colorant rouge fluorescent qui est une membrane imperméable. Ainsi les cellules vivantes fluorescent «verte» tandis que les cellules mortes présentent à la fois «verte» et «rouge» des émissions. Utilisez la configuration introduit en 2.2) pour la détection de fluorescence verte / rouge. Utiliser un portable, mini-agitateur magnétique (Utah Biodiesel Supply, Utah) pour remuer les suspensions de cellules dans une seringue de 3 mL de BD Plastipak équipé d'un agitateur magnétique 7mm pour empêcher la sédimentation des cellules. Cartographie des évènements mélangeant à l'aide FLIM Focus du volume de la sonde optique à la moitié de la hauteur d'un micro-canal le long de laquelle les gouttelettes sont fluides. Gouttelettes forment à partir de deux solutions aqueuses (comme dans la figure 3c), contenant chacun un fluorophore (sans interaction) avec des caractéristiques différentes vies fluorescentes. Début d'un côté de la chaîne, effectuer chaque expérience sur toute la largeur du canal à intervalles de 1 um. Le canal de edges peuvent être facilement identifié comme l'intensité de fluorescence diminue drastiquement une fois que le faisceau laser est focalisé dans leur proximité. Mettre en œuvre un algorithme permettant de différencier rafales de signaux (associés avec des gouttelettes) à partir du bruit de fond de la phase huileuse et d'établir la durée de chaque salve. Mettre en œuvre un second algorithme pour extraire le temps de retard et les valeurs d'intensité le long de la longueur de chaque gouttelette à la largeur particulier où l'expérience a été réalisée 9. Ensuite, utilisez un estimateur du maximum de vraisemblance (EMV) algorithme pour évaluer la durée de vie de fluorescence pour chaque gouttelette dans l'expérience 8. Moyenne des valeurs à vie pour tous les gouttelettes dans l'expérience, réduit l'erreur final du calcul MLE (les gouttelettes plus sondée, la plus l'erreur). Une fois une trajectoire à vie a été obtenu pour chaque largeur, mélanger tous les trajectoires dans une carte 2D. Comme chaque valeur de durée de vie est associée à un particulierLAR mélange des deux fluorophores, une concentration (ou mélange) de la carte peut ainsi être obtenue. En option, une carte 3D des gouttelettes de mélange peut être facilement obtenue en répétant ce protocole à différentes positions le long de la hauteur du canal microfluidique. 5. L'analyse des données Réinterpréter les premières expériences des fichiers de données dans le langage informatique appropriée afin qu'ils puissent être analysés ultérieurement (par exemple, des fichiers texte qui contiennent la variation de la numération des photons avec le temps, peut être facilement extrait en Matlab pour le traitement des données et analyse). Vous pourriez avoir à écrire des codes spécifiques pour accéder aux données contenues dans les fichiers des expériences plus complexes (tels que ceux pour FLIM) ou afin d'exécuter des algorithmes MLE ou de construire des cartes en 2D bagouts de mélange de trajectoires vie. 6. Les résultats représentatifs Reconnaissance des cellules Des exemples typiques du Variation des comptages de photons en fonction du temps pour les expériences basées sur les cellules sont représentées dans les figures 4a et C, sur une période de deux cents millisecondes. Surtout le bouillon Luria-Bertani (milieu LB) agit comme un fond faiblement fluorescentes définir les limites de gouttelettes aqueuses, tandis que des éclats distincts photon, correspondant à la présence de cellules individuelles, peuvent être distinguées sur le dessus de ce fond. Le fond LB fluorescente est caractérisé par une section approximativement rectangulaire (marqué par les lignes rouge et verte en pointillé). La largeur maximale à moitié plein (LMH) de salves fluorescente provenant de E. cellules coli est 30 fois plus courte que les événements de gouttelettes de fond, qui est compatible avec la longueur relative des gouttelettes (40 microns, ce qui correspond à un volume de 30 picolitres) et E. cellules coli (1,5-2,0 microns) 10. Avec le dual channel de détecterion du système, l'existence de cellules vivantes ou des cellules mortes peuvent être distingués de l'analyse des canaux vert et rouge. figures 4 b et d montrent la distribution de probabilité décrivant le nombre de cellules par des gouttelettes. Cartographie des évènements mélangeant à l'aide FLIM La durée de vie de fluorescence moléculaire est une propriété intrinsèque d'un fluorophore individuel qui n'est affectée que par son environnement chimique. En conséquence de ses mesures peuvent être utilisées pour obtenir des informations sur l'environnement (comme pH de la solution, la température, la polarité et viscosité) avec une résolution supérieure et une précision que le temps intégré des mesures de fluorescence, qui sont dépendants de facteurs expérimentaux (tels que la concentration, l'intensité d'excitation, et la collecte des optiques l'efficacité). 9,11 Comme présenté ailleurs, 8, il est possible de cartographier les modèles de mélange à l'intérieur de gouttelettes en utilisant deux fluorophores avec diLes valeurs à vie fférents. Dans un mélange contenant deux (sans interaction) des espèces fluorescentes de la désintégration va prendre une forme biexponentielle comme il est montré dans l'équation 1: Les durées de vie individuelles sont définies comme τ1 et τ2, et l'amplitude de chaque composante est donnée par α1 et α2 respectivement. La durée de vie moyenne peut alors être définie comme suit: Où β1 β2 et sont la fraction de chaque composant et sont définis comme suit: Puisque le volume sonde est fixée et les gouttelettes sont coulant à travers cette position, une trajectoire de la durée de vie des valeurs sur toute la longueur des gouttelettes à cette largeur particulier peut être ainsi obtenues. Une trajectoire caractéristique pour une largeur particulière, averagED 6000 parmi les gouttelettes, peut être observé dans la figure 5a. Combinant les trajectoires à travers toute la largeur de la voie conduisant à la formation d'une concentration en 2D (ou mélange) carte. Un résultat typique est présenté sur la figure 5b. En faisant la moyenne des résultats auprès d'un grand nombre de gouttelettes, l'erreur-type des résultats obtenus peuvent être considérablement réduits (1% d'erreur standard avec un intervalle de confiance à 95% pour la figure 5a). La méthode de détermination de la trajectoire de vie suppose que toutes les gouttelettes sont pratiquement identiques. Ceci est prouvé d'être largement correct pour deux raisons principales: si des gouttelettes sont significativement différentes, la durée de vie moyenne des trajectoires aurait obtenu plus plat, moins profils divergents (et des différences marquées dans la vie le long de la longueur de la moyenne des gouttelettes sont systématiquement détectés). Par ailleurs, les résultats sont reproductibles quel que soit l'individugouttelettes analysées ou la quantité de gouttelettes utilisées dans les calculs. 8 Flux de processus Figure 1. Sur la fabrication de puces microfluidiques. La figure 2 un diagramme), représentant les pompes à seringues et des seringues, connecté à la puce microfluidique pour la formation de gouttelettes; Représentation schématique b) d'une configuration typique d'un laser optique pour deux à deux fluorophores (vert et rouge) d'excitation et de détection.. DC = miroir dichroïque, EM = filtre d'émission, L = Lens, PH = Pin Hole, APD = détecteur photodiode à avalanche. Figure 3 sur puce stratégies la formation de gouttelettes: a) des flux de mise au point de configuration; b) T-jonction de configuration.. c) Sur l'encapsulation de puces dans le droplets l'origine de deux réactifs séparés aqueuse. Figure 4 lecture optique de 0,2 s traces enregistrées pour (a) morts et (c) des cellules vivantes (taux de flux pour cellules en suspension: 1 min -1 ul, huile: 2 min ul -1).. Chaque signal en forme d'arc correspond au milieu LB faiblement fluorescent qui forme la gouttelette aqueuse, avec des limites de gouttelettes marqué par des lignes pointillées. Signaux verts représentent lecture sous signaux 633nm et rouge plus de 633 longueurs d'onde nm. Les cellules sont distingués par la flambée verticale résultant de l'colorants intercalant de l'ADN. Distribution de probabilité pour l'occupation cellulaire dans les gouttelettes unique pour (b) les cellules mortes et (d) des cellules vivantes. Figure 5 a) la durée de vie moyenne de la trajectoire typique le long d'une goutte sur une largeur particulière;. B)Représentation typique de la combinaison de toutes les trajectoires en moyenne sondé sur toute la largeur des gouttelettes dans une vie 2D (ou la concentration, exprimée en% FITC /% Str-AF488) carte.
