Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses
Summary
Se describe un método relativamente simple de transretinal electrorretinograma (ERG) para la obtención de grabaciones photoresponses conos y bastones de la retina del ratón intacto. Este enfoque se aprovecha del bloque de la transmisión sináptica de fotorreceptores para aislar sus respuestas de luz y grabar usando electrodos colocados sobre el terreno a través de la aislada plana montada en la retina.
Abstract
Hay dos clases distintas de formación de la imagen-los fotorreceptores de la retina de los vertebrados: los bastones y conos. Los bastones son capaces de detectar fotones individuales de luz, mientras que los conos de funcionar de forma continua en las cambiantes condiciones de luz brillante. La absorción de luz por la A-Rod y específicos de cono pigmentos visuales en los segmentos externos de fotorreceptores desencadena una cascada de fototransducción que finalmente conduce al cierre de los nucleótidos cíclicos-bloqueados los canales de la membrana plasmática y la hiperpolarización de la célula. Este cambio inducido por la luz en la membrana de actuales y potenciales pueden ser registrados como una foto-, ya sea por 1,2 de electrodos de aspiración clásica técnica de grabación o grabaciones transretinal electrorretinograma (ERG) de retinas aisladas con componentes farmacológicamente bloqueados respuesta postsináptica 3-5. Este último método permite drogas accesibles duraderos grabaciones de fotorreceptores de ratón y es particularmente útil para obtener photoresponses estables from los conos de ratones escasos y frágiles. En el caso de los conos, estos experimentos se puede realizar tanto en las condiciones adaptados a la oscuridad y la iluminación intensa siguiente que blanquea prácticamente todos pigmento visual, para supervisar el proceso de recuperación de cono de fotosensibilidad en adaptación a la oscuridad 6,7. En este video, vamos a mostrar cómo llevar a cabo de vara y M / L de cono-impulsadas por las grabaciones de transretinal adaptada a la oscuridad retina del ratón. Grabaciones Rod se llevó a cabo utilizando retina de tipo salvaje (C57BL / 6) ratones. Por simplicidad, las grabaciones de cono se obtendrá a partir modificado genéticamente varilla transducina α-subunidad extractor (Tα – / -) ratones que carecen de barra de señalización 8.
Protocol
Discussion
El método de los bastones, los conos y las grabaciones basadas en transretinal-ERG se ha descrito anteriormente se está convirtiendo en una poderosa herramienta para la investigación de la función de los fotorreceptores de ratón en el tipo salvaje y animales modificados genéticamente. Además de la caracterización de las propiedades de fácil fotorrespuesta básicos, esta técnica simple proporciona estabilidad durante gran respuesta de larga duración experimentos realizados en preparaciones retina cercana al in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Con el apoyo de premio a la Trayectoria para el Desarrollo de la Investigación y Prevención de la Ceguera, las subvenciones del NIH EY19312 y EY19543 (VJK), así como por la subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera y la EY02687 (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la Universidad de Washington).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| DL-AP-4 | TOCRIS bioscience | 0101 | ||
| All other reagents | Sigma-Aldrich | |||
| Glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | For making electrodes | |
| Filter paper | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| Photometer | UDT Instruments | S350 | For light calibration | |
| Radiometric silicon sensor | UDT Instruments | 221 | For light calibration | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | To minimize mechanical noise | |
| Air compressor Panther P 15TC | Werther International | P 15TC | Connected to anti-vibration table | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ9.5 | For mouse eye dissection | |
| Infrared image converters | B.E.Meyers | ProwlerTM | Bound to stereomicroscope | |
| Differential amplifier DP-311 |
Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | 1440A | ||
| Dual Channel 8-pole Filter | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Ceramic resistor | TE Connectivity | CGS SBCHE618RJ | For reheating the perfusion solution | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Temperature monitor | Omega | DPi32 | Connected to thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics/ Optek Technology | Digi-key P/N 365-1185-ND | To apply test flashes/bleaching light | |
| Cautery pen | Bovie | AA25 | For marking the dorsal part of the mouse eyeball | |
| pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices |
References
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
- Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
