La ampliación de los cultivos celulares de mamíferos con un frasco de varias capas de Nueva

1. Protocolo para el uso de varios frascos de cultivo celular Preparación de los buques y la adición de la suspensión de células Preparar el medio de crecimiento de las células según sea necesario. Alinee Multi-frasco vertical sobre su lado con la tapa hacia arriba sobre la superficie de trabajo (campana estéril de flujo laminar). Estos frascos están disponibles en tres formatos y de 5 capas y el uso de un similar patrón de flujo de trabajo como un frasco T-175. Aflojar y remover las tapas. Añadir la cantidad necesaria de pre-calentado medio en un matraz con una pipeta de 50 o 100 ml o por infusión. Pipetas que son ≤ 10 ml puede llegar al fondo de la vasija, cuando varios frascos se colocan verticalmente con la tapa hacia arriba. ≥ 10 ml pipetas pueda llegar hasta el buque inmediatamente pasado el logotipo en el frasco de Multi-, proporcionando así un portal conveniente de añadir un mayor volumen de medios de comunicación para los buques. Para evitar la propagación del medio, permiten flujo de líquido a flómo lo largo de la pared interna de la tapa del Multi-frasco (logo-lado). Añadir suspensión celular de una reserva de células concentradas en un medio de crecimiento a través de la capa superior con una pipeta de 10 ml y frascos de tapa. Consejos: – Transporte Multi-frascos en un carro al sitio de la incubadora y realizar los pasos restantes. – La densidad de siembra de células puede variar dependiendo del tipo de célula, media y duración de la cultura necesita. Comience con la densidad de siembra y el volumen de los medios de comunicación al que se utiliza en el estándar T-175 frascos y se multiplica por 3 o 5 en función del frasco de Multi-formato utilizado. La mezcla de células Mix posición: Sostenga el frasco en posición vertical Multi-con el logotipo de frente a usted y a su vez hacia la izquierda a un ángulo de 45 ° con el puerto de mezcla frente a usted. La celebración en el mismo ángulo, con cuidado de inclinación Multi-frasco de adelante hacia atrás (en el cuello lejos de usted) hasta que el líquido en la capa superior drena totalmente downwards a través del puerto de mezcla. Giran en torno a la mezcla de babor. Del mismo modo, agite suavemente Multi-frasco de atrás hacia adelante (el cuello hacia usted) hasta que esté medio drena por completo de la capa de abajo hacia arriba a través del puerto de mezcla. Repita los pasos 1.2.2 y 1.2.3, una vez más para asegurar una mezcla adecuada. Lleva Multi-frasco de nuevo a la posición de mezcla (paso 1.2.1) y vaya al paso 1.3 Por otra parte, la suspensión de células se pueden preparar externa del frasco Multi-y la suspensión de células se puede agregar a la embarcación con una pipeta o suave vertido. Puerto de combinación permite en recipiente de mezcla de células con los medios de comunicación y elimina la necesidad de hacer grandes cantidades de células en suspensión externa. También permite la igualdad de medios a través de las capas de la Multi-frasco El equilibrio de fluidos Luego de mezclar / adición de la suspensión celular, lugar Multi-frasco vertical sobre una superficie plana para igualar el volumen de líquido ecuaciónlly en todas las capas. Separación líquido en cada capa Sostenga el frasco de Multi-con el logotipo hacia arriba y gire hacia la derecha a un ángulo de 45 ° a la partición del líquido en cada una de las capas. Consejo: – Para obtener mejores resultados, es importante utilizar una superficie plana para los pasos 1.3-1.4 Transporte Una vez que los medios de comunicación que contiene la suspensión de células se divide, transporte Multi-frasco en el mismo ángulo de 45 ° (a la derecha) como en el paso 1.4.1 con los medios de comunicación del puerto mezcla en incubadora. Esta posición también es adecuado cuando la eliminación de frascos de la incubadora para su visualización en un microscopio. La colocación de Multi-frasco en incubadora útil La celebración de Multi-frasco en el ángulo de 45 ° (a la derecha, lejos de la mezcla de un puerto), gire suavemente hacia abajo en posición horizontal en la superficie de la incubadora (utilizando la esquina del puerto como una mezclapivote). Coloque Multi-frasco con el logotipo hacia arriba. Falcon Multi-frasco de diseño permite a los barcos que se apilan y se las mantiene en su lugar por una costilla resistente de apilamiento. Distribución de células y los reactivos Después de la colocación de Multi-frasco de planos en la superficie de trabajo, con suavidad hacia adelante y atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente sobre las superficies de las células de la cultura teniendo cuidado de no derramar el líquido de cada capa. Pila de frascos. Este frasco es de un material ópticamente transparente y las células de la última capa se pueden ver fácilmente en un microscopio. Medios de intercambio Aspirar mientras se inclina el frasco Multi-a la izquierda (mezcla de babor) con el logotipo hacia usted. A continuación, la inclinación, el frasco de Multi-a la derecha, sigue aspirar todos los medios de comunicación residual. Agregue la cantidad adecuada de los medios de comunicación y siga los pasos 1.3-1.7 2.La recolección de células multi-Frascos Para disociar las células, se alinean varios frascos vertical y llevar a cada uno a la mezcla de posición (paso 1.2.1). Invierta suavemente frascos con cuello de frente a usted a fin de que los medios de comunicación para drenar la capa superior de la Multi-Flask. Inserte un 5 o 10 ml de la punta de aspiración a través del cuello hasta llegar a nivel de líquido cerca del puerto de mezcla. Aspirar medio agotado. Añadir disociación reactivo / tampón de lavado y llevar a la posición de la mezcla como en el paso 1.2.1, a continuación, proceder y seguir los pasos 1.3 a 1.7. Neutralizar con medio de cultivo / agente de neutralización y se vierte la suspensión de células en un tubo receptor o invertir frasco de manera que las células de drenaje para la capa superior de la nave y recoger las células con una pipeta de 10 ml. Consejo: Para mejorar la recuperación de las células o de los reactivos, llevar Multi-frasco para mezclar la posición (paso 1.2.1), invertir con el cuello hacia el operador para permitir el drenaje completo de los medios de comunicación de Al l capas de la capa superior. Luego, incline Multi-frasco de las agujas del reloj a 45 º (distancia desde el puerto de mezcla), mientras que el frasco de Multi-sigue siendo invertida. Utilice una pipeta (1-10 ml) para recoger el resto de los reactivos. 3. Volumen de trabajo recomendado en Falcon Multi-Frascos Medios de cultivo 3-Capa: 75-150 ml por Multi-frasco 5-Capa: 125-250 ml por Multi-frasco La disociación del agente 3-Capa: ≥ 15 mL por Multi-frasco 5-Capa: ≥ 25 ml por frasco de Multi- Sugerencia: Comience con un volumen de medio utilizado en la norma T-175 frascos y se multiplica por 3 o 5 veces dependiendo del frasco de Multi-formato de evaluación para que ml por unidad de superficie sigue siendo el mismo. 4. Los resultados representativos: 1. Diseño de Falcon Multi-frasco files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/> . Figura 1: Multi-frasco de cultivo celular barcos están disponibles en 3 – y 5-capa formato apilable para ampliación de las células proporcionando 525 y 875 cm 2 de superficie de crecimiento, respectivamente. Pipeta de acceso facilita la adición y la eliminación de las células y los reactivos en y fuera de la nave. Presencia de la mezcla de puertos permite la rápida en recipiente de mezcla y ecualización de los medios de comunicación en todas las capas de la Multi-frasco. 2. Rendimiento celular utilizando Multi-Frasco: Estas embarcaciones están disponibles en 3 capas y formatos de 5 capas que corresponden a 3 y 5 veces la superficie de la T-175 frascos. En consecuencia, ≥ 3 y 5 veces (130 ± 6,8 x 10 6 y 218 ± 23.6 x 10 6 células, respectivamente), el número de células BHK-21 (riñón de hamster) las células fueron cultivadas y se recuperó de Multi-frasco en comparación con el T-175 frascos (43,2 ± 3,5 x 10 6 células; Fig.2a). Celular rendimiento por uárea de superficie de nit fue equivalente en 3 – y 5-capa y multi-frascos T-175 frascos de BHK-21, LNCaP (adenocarcinoma de próstata humana línea celular), Hep-G2 (línea celular humana hepatocarcinoma), Ecopack 2-293 (humanos línea de células renales) cultivadas por un período de 48-96h (Fig.2b) en medios de cultivo (35 ml por cada capa) según lo recomendado por el fabricante de células (ATCC, Sigma y / o Clontech). Las células fueron enumerados en un sistema automatizado de Vi-contador de células (1). Figura 2A: de tres y cinco veces el número de células BHK-21 se cultivaron y se recuperó de 3 – y 5-capa Multi-Frascos en comparación con el T-175 frascos. Rendimiento esperado se determinó que el rendimiento en media de células de control T-175 frascos multiplicado por tres veces y cinco para el 3 – y frascos Multi-5-capa, respectivamente (n = 4 frascos / formato). <br/ 2B> Figura: el rendimiento de la célula por cm 2 fue equivalente en 3 – y 5-capa y multi-frascos T-175 frascos de BHK-21, LNCaP, y las células HepG2 EcoPack2-293. Cada barra representa la media de 4 a 6 frascos. Células BHK-21 (11.000 células/cm2) se cultivaron durante 72 horas, las células LNCaP (20.000 células/cm2) y EcoPack2-293 células (~ 35.000 células/cm2) se cultivaron durante 96 horas y las células HepG2 (25.000 células / cm 2 ) se cultivaron durante 48 horas antes de la cosecha. 3. Medios de distribución entre las capas de Multi-frasco Medio de cultivo celular (DMEM, Invitrogen) a cinco capas múltiples frascos (250 buques mL/5-layer) y se separó en capas de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Distribución de los medios de comunicación se midió mediante la perforación de agujeros en cada capa y los medios de comunicación bombea desde las capas individuales. Peso del fluido recuperado de cada capa se encontró que era relativamente uniforme de capa a capa, como se muestra en la Fig. 3. Son los siguientes: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (g). Figura 3. Distribución de los medios de comunicación uniforme en cada una de las cinco capas de una capa de 5-Multi-Flask. Medio de cultivo celular fue introducido en varios matraces (250 buques ml/5-layer), equilibrado y dividido en capas individuales. Los medios de comunicación se bombea a través de agujeros perforados en las capas individuales y el peso de fluido se registró a partir de cada capa (n = 6 frascos). 4. Celular distribución entre las capas de Multi-frasco Las células pueden ser añadidos y mezclados dentro del frasco de Multi-. Nos distribución simulada de las células entre las capas de Multi-frasco con gotas (10μm; Polysciences Inc.) de tamaño similar a las células. Suspensión de bolas se añadió en el recipiente Frasco de Multi-utilizando una pipeta de 10 ml a través de la capa superior y se mezcla con los medios de comunicación en el barco, como described en el protocolo anterior. Distribución de bolas se midió por los agujeros de perforación en cada capa y el líquido que contiene suspensión de bolas se bombea desde las capas individuales. Concentración de bolas recuperadas de cada capa se leyó en un contador Coulter y grabado. Se muestra a continuación son equivalentes entre capas distribuciones de grano de 3 capas múltiples frascos (Fig.4a). La mezcla de puertos permite la distribución homogénea de las células y los reactivos entre las capas Multi-Flask. Figura 4: Distribución de bolas en cada una de las tres capas de una capa de 3 Multi-Flask. Una suspensión de cuentas (3,6 x10 6 / ml) se añadió al medio se distribuye en varios matraces (suspensión de perlas: el volumen de los medios de comunicación es de 1:10, vol: vol) y se mezcla, seguido por el equilibrio y los pasos partición utilizando el protocolo descrito. Concentración de bolas recuperadas de cada capa (medio bombeado a través de agujeros perforados en cada capa) fue leído en un recuento de Coulterer y grabado. Se muestra a continuación son equivalentes entre capas distribuciones de cuentas en 3 – Multi-capa de Frascos (n = 5 frascos) A continuación se muestran imágenes representativas de los patrones de coloración Ecopack 2-293 de las células cultivadas a la confluencia> 80% en tres capas múltiples frascos de medios de cultivo suplementados. Monocapas de células fueron fijadas y teñidas con cristal violeta y Multi-frasco capas fueron cortadas y las imágenes escaneadas (2). Tenga en cuenta, los patrones de células fue homogénea en todas las capas de Multi-Frasco (Fig.4B). Se obtuvieron resultados similares con múltiples tipos de células evaluados (datos no mostrados). Figura 4B: Esta figura ilustra el crecimiento de células homogéneas entre las capas de varios frascos. Ecopack-2-293 células cultivadas a la confluencia> 80% en 3 capas múltiples frascos y T-175 fueron fijadas y teñidas con cristal violeta. Frasco de múltiples vasos fueron cortadas y cada capa manchada escaneado fue. 5 El suministro de aire en el Multi-Flask.: El análisis de los medios de comunicación dedicado al uso de Bioprofile FLEX analizador (3,4) (Nova Biomedical) de EcoPack2-293 células cultivadas durante 96 horas no mostraron diferencias en la saturación del aire de las células cultivadas en varios frascos de 5 capas vs T-175 frascos (81.03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% del ambiente O 2). Figura 5: saturación del aire (ambiente% O 2) de los medios de comunicación pasaron fueron similares en los medios de comunicación pre-mezclado de varios frascos de 5 capas vs T-175 frascos. EcoPack2-293 células se sembraron a una densidad de 35.000 células / cm 2 y se cultivan durante 96 horas antes a los medios de análisis (n = 3 frascos).