小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

1。ターゲットのクローニングは、融合構築物をgene/ABDz1-tagged 発現プラスミドに目的遺伝子（プラスミド含むABDz1は材料移転契約を通じて自由に利用可能である）のN末端ライゲーションのための適当な制限部位に隣接ABDz1遺伝子のPCR断片を準備する。 適切な反応バッファーで選択した制限酵素による開裂精製発現ベクターとPCR断片。ライゲーションの前に製品を精製する。 目的の遺伝子を含む発現ベクターに制限されたABDz1断片をライゲーションし、E.にライゲーション産物を変換大腸菌 （元のメソッドでRR1ΔM15ひずみが8を使用していた）。選択のための適切な抗生物質を補充した寒天プレート上で形質転換細胞を広げる。 PCR画面少数のコロニーとシーケンスは、DNAシーケンシングにより得られた発現カセットを確認してください。 シーケンスverifの一晩培養液からプラスミド準備IEDコロニーと好ましい発現株（ヒト遺伝子がコードするタンパク質の産生を向上させるためにプラスミドpRAREをホスティングしているロゼッタ元のメソッド大腸菌 （DE3）、で、使用された）に変換。 2。タンパク質発現 5g / lの酵母エキスと適切な抗生物質を補充したトリプシン大豆ブロス10mlに単一の細菌コロニーを接種。 37℃で一晩150rpmでインキュベートする。 100ミリリットルの新鮮な培地で一晩培養液1mlを接種し、細胞が対数増殖期に達するとタンパク質発現（lacオペロンを利用したイソプロピル-β- D -チオガラクトシド本来の1mM）を誘導する。 遠心分離で25℃一晩と収穫細胞で150rpmでインキュベートする。 3。直交アフィニティー精製 25ミリリットルランニングバッファー（25mMのトリス- HCl、200 mMのNaCl、1mMのEDTA、0.05％（w / v）のTween 20を、pH8.0）にペレットを再懸濁し、目を混乱させる60％の振幅と3分間1.0/1.0パルスで超音波処理によってEが細胞。サンプルを遠心し、さらに精製する前に、上清を（0.45μM）を含む標的タンパク質をフィルタリング。 適切なタンパク質精製システムで、1ml /分でバッファを実行しているの10カラム体積（CV）を使用して、以前に販売業者の勧告によるとHSAとの結合のどちらか1ミリリットルHSAセファロースカラムまたはNHS -活性化カラムを、平衡化させます。 0.5ml /分で細菌のライセートをロードして、流速は1ml /分にリセットされます。 洗浄バッファーの5 CV（5 mMのNH 4 AC、pH5.5）に続いて実行されているバッファの5 CVでカラムを洗浄。 1ml /分で溶出バッファー（0.5 M HAC、pHは2.5）でサンプルを溶出し、さらに精製するための溶出ピークからの画分を選択するには280nmで、モニターの吸収を画分を集めた。 プール最高タンパク質濃度と分画は、確かにランニングバッファー（20mMリン酸、150mMのNaCl、pH7.2）中で2回希釈し、pHが中性付近であることを確認してください。 pHは必要に応じて増加させる1 Mトリス塩酸pHが8を追加します。 1ml /分で確かにランニングバッファーの10 CVで平衡化した1mlのハイトラップのMabSelect確かカラムに0.5ml /分でサンプルをロードします。ローディング後1 ml / minの流量をリセットします。 確かにランニングバッファーの5 CV（ステップ5）でカラムを洗浄し、0.2 M HAC、pHは2.7でタンパク質を溶出させる。敏感な標的タンパク質の場合は溶出液は、トリス- HClの添加によっては採取後、直接中和することができる。 クロマトグラフィー工程はMabSelectの溶出液を逆にしている場合は確かにカラムを緩衝液（ステップ3.1）実行中に希釈し、pHは1 Mトリス- HClを加えて約8に増加することができます。確かに行列は第二段階で採用されている場合、一般的に、狭いピークが観察される。 4。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS – PAGE）により純度の評価で精製した画分をロードするSDS – PAGEを削減し、必要に応じて、質量分析法により精製物の分子量を分析する。 ABDz1の遊離システインは、非還元条件下での製品の二量体化を引き起こす可能性があるので、それはサンプルを完全に削減することが重要です。 5。代表的な結果： 原理の証明として、ABDz1タグによって促進された直交アフィニティー精製は、異なる溶解性クラス、分子量および等電点（表1）を表す3つのヒト標的タンパク質を評価した。 ABDz1遺伝子が遺伝的に標的遺伝子に融合され、構造が大腸菌で発現され、図2は、連続してメソッド内のすべてのステップのためのフローチャートを示しています。直交プロトコルによる精製の後、異なる時点で採取した試料は、SDS – PAGE（図3）により分析した。結果は明らかに二重のタグが二高度に特異的な精製段階の有用性を示す。合理的な純度はACであるにもかかわらず、としてゲルから見た初期精製ステップの後にhieved、連続的なステップはよく非常に要求の厳しいアプリケーションに最適な非常に純粋な生成物が得られる。 図1二重特異性ABDz1タグの選択に使用するコンビナトリアルライブラリーのデザイン。 46アミノ酸アルブミン結合ドメインの安定threeヘリックス束に折り目と、それは主に第2ヘリックスに位置するヒト血清アルブミンに対する結合部位が含まれています。遺伝的にファーストとサードヘリックスに位置eleven表面露出アミノ酸をランダム化することにより、新規の結合面が設計されました。 elevenの位置は図に示され、Kraulisらによれば、番号が付けられています。9。ファージ上に発現するコンビナトリアルライブラリとブドウ球菌蛋白質のZ -ドメインの二量体に対するバイオパニングに続いて、二重特異性ABDz1分子が同定された。 <iMG ALT ="図2"SRC ="/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg"/> 図2。直交アフィニティー精製プロトコールの簡易フローチャート。 ABDz1配列を含むPCRフラグメントを適当な発現ベクターに目的の遺伝子で（N末端）連結されている。ライゲーション産物を大腸菌に形質転換されるシーケンスの検証とプラスミド調製用の大腸菌 。発現宿主に形質転換後、組換えタンパク質発現のための大量培養は、最初の一晩培養から設定されています。細菌を遠心分離により回収し、標的タンパク質を含む細菌溶解物を生成するために超音波処理によって溶解されています。残留固体粒子を除去する濾過工程の後、ライセートは、連続する二つの精製工程を経ることにより、液体ハンドリングシステム上で直交するアフィニティー精製に供される。両方の精製工程からの溶出ピークをサンプリングし、評価をSDS – PAGEにより純度を評価するとtを比較し彼は、精製前にライセート。 ABDz1と融合して発現し、精製した標的タンパク質の図3。SDS – PAGE分析。 異なる特性を表すABDz1、、とABDz1タグ自体に融合で表現三つのタンパク質の細菌溶解物から採取したサンプルは、確実なカラムMabSelect続いてHSA -カラム上で精製から対応するピークからのサンプルと一緒に採取された（） 。レーン1-4 9-12 MabSelect確かに精製（第二段階）から精製、HSA -精製からレーン5-8（第一段階）と車線の前に溶解液からサンプルを表します。 ABDz1 – 141377、ABDz1 – HT875、ABDz1 – HT2375とABDz1：サンプルは次の順序で読み込まれます。さらに、同じ列に逆の順序で精製した同じ溶解物から取得したサンプルを分析した（B）。 1から3レーンは、精製前にライセートからレーン4-6 fをサンプルを表してHSA -精製（第二段階）からROM MabSelect確実な精製（第一段階）とレーン7-9サンプルは、（A）が、タグ自体が含まれていないのと同じ順序でロードされた。これらの結果から、この二段階方式に関係なく手順が適用される順序の高度に精製したタンパク質をもたらすことは明らかである。 名前B 標的タンパク質 UNIPROT C 分子重量（分子量） 溶解度クラスD 分子融合産物（分子量）の 等電点融合産物の 141377 B7Z315 17.4 4 23.7 8.5 HT875 P01040 10.8 3 17.1 4.9 HT2375 P00740 8.9 5 15.2 6.8 単独でABDz1タグの分子量は6.3 kDaの、等電点6.7です。 標的タンパク質は、UniProtのタンパク質の一部を表します。 http://www.uniprot.org 。 N -末端His 6 ABP 10のタンパク質断片の溶解度クラス。 表1。 ABDz1タグと標的タンパク質との融合製品は、原理の研究の証拠で評価。 異なる分子量、溶解性及び等電点を持つ3つのユニークな人間のタンパク質は、直交する親和性のアプローチによって発現および精製のために選ばれた。