Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em
Summary
E12.5 fare embriyonik Ortabeyin Organotipik dilimler oluşturmak için bir yöntem açıklanmıştır. Organotipik dilim kültürleri dopaminerjik nöronlar veya diğer ventral orta beyin nöronları davranışını gözlemlemek için kullanılabilir.
Abstract
Fare, moleküler ve genetik veri bolluğu nedeniyle memeli beyin gelişimini incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Ancak, fare embriyo ulaşılmaz ve opak gelişmekte olan fare beyin kolay manipülasyon ve in vivo görüntüleme için uygun değildir. Bu nedenle embriyonik beyinleri Organotipik kesit kültürleri, in vitro fare beyin gelişimini incelemek için yaygın kullanılır. Ex-vivo gen ekspresyonu manipülasyon ya da transgenik farelerin değişikliğine izin verir, böylece nöronal veya glial hücrelerin alt popülasyonlar floresan proteinleri ile etiketlenmiş. Etiketli hücrelerinin davranış time-lapse görüntüleme kullanarak görülebilir. Time-lapse görüntüleme geç embriyonik aşamalarında 1-2 serebral korteks gelişiminin altında yatan hücre davranışları çalışmak için özellikle çok başarılı olmuştur. Embriyonik Organotipik dilim kültür sistemleri önbeyin dışında beyin bölgelerinde daha az iyi established. Bu nedenle, nöronal hücre göçü anlatan time-lapse görüntüleme verileri zenginlik önbeyin 3,4 ile sınırlı. Hala dorsal beyin keşfedilen ilkeler ventral beyin alanları için geçerli olup olmadığı bilinmemektedir. Nöronlar ventral beyin nöron kümeleri yerine katmanlar halinde organize edilen ve genellikle karmaşık göçmen yörüngeleri son konuma geçmesi gerekiyor. Ventral orta beynin ventral beyin gelişimi için sadece iyi bir model sistem değildir, aynı zamanda bu tür hastalık süreçlerinde ilgili dopaminerjik nöronlar gibi nöron popülasyonları içerir. Dopaminerjik nöronların fonksiyonu ve dejenerasyon, yetişkin ve yaşlanmanın beyin çok detaylı olarak incelenmiştir olsa da, kendi farklılaşmasını ve göç faz 5 sırasında bu nöronların davranışları hakkında çok az bilinmektedir. Biz burada embriyonik gün (E) 12.5 fare ventral orta beyin dilim kültürlerin üretimi açıklar. Bu dilim kültures potansiyel olarak, in vitro olarak birkaç gün içinde dopaminerjik nöron gelişimini izlemek için uygun . Biz bu embriyonik gelişimin erken safhalarında, beyin dilimleri üreten kritik adımları vurgulamak ve in vitro dopaminerjik nöronların normal gelişimi sağlamak için gerekli koşulları tartışmak . Ayrıca, mevcut sonuçları zaman atlamalı görüntüleme deneyleri. Bu deneylerde, ventral orta beyin öncüleri (dopaminerjik öncüleri de dahil olmak üzere) ve onların soyundan Cre / loxP tabanlı indüklenebilir kaderi haritalama sistemi 6 kullanarak bir mozaik şekilde etiketlenir.
Protocol
Discussion
Burada sunulan Organotipik dilim kültür yöntemi embriyonik ventral orta beyindeki dopaminerjik nöronlar ve onların göç ve projeksiyon yolları geliştirmek in vitro analizi kısa vadeli bir sistem sağlar. Biz ventral orta beyin dopaminerjik nöronların normal gelişimini sağlar dilimler elde etmek için özenle dikkat edilmelidir protokol kritik adımlar bir dizi olduğu bulundu. En kritik adım diseksiyonu embriyonik beyin, hızlı ve hassas olmak zorundadır. Yetişkin beyin dilimleri nesil aksine, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Martine Emond ve Isabel Brachmann Organotipik dilim kültür sistemi ve Wolfgang Hübner ve yazının eleştirel okuma Liviu Gabriel Bodea kurulmasında yardım ettikleri için teşekkür ediyorum. Biz Frank Costantini Shh CreER fareler için R26 muhabiri fareler ve Cliff Tabin için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada, Kuzey Ren-Vestfalya (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland) Bilim ve Araştırma Bakanlığı Araştırma Ödülü tarafından finanse edildi.
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-29 (2007).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).
- Legue, E., Joyner, A. L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).
- Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc. , (2007).
- Harfe, B. D. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-517 (2004).
- Srinivas, S. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).
- Joksimovic, M. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).
- Blaess, S. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).
