Параллельные пластины палаты потока и непрерывной цепи потока для оценки эндотелиальных клеток-предшественников при ламинарном Стресс сдвиговом потоке

1. Эндотелиальных клеток-предшественников изоляции До любой коллекции периферической крови человека, представить свое исследование протокола к Институциональным наблюдательным советом (IRB), и после его утверждения, получить добровольцев доноров обоснованного согласия (периферическая для сбора крови и EPC изоляции был одобрен IRB Университета Дьюка и находится в полном соответствии с американскими нормативные требования, связанные с защитой человеческой участников исследования). При работе с животного происхождения ЕРС, ваш протокол исследования утвержденным вашего Уходу за животными и использованию комитета (IACUC). Все наши эксперименты свиньи были одобрены Университета Дьюка IACUC, и проводилось в соответствии с высочайшими стандартами гуманной помощи. Для изоляции эндотелиальных клеток-предшественников, собирают 50 мл периферической крови по стандартной методике кровопускания из согласился добровольно донорами в кровь сбор мешков с антикоагулянтами citratэлектронной фосфата декстрозы и разбавьте раствор 1:1 с буферном растворе соли Хэнка (без CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4) и слоем на равных объемов Histopaque для создания четко определенных слоев. Центрифуга (30 мин, 740 г, низкие настройки перерыва) и собирать мононуклеарных клеток (МНК) (лейкомассы) слой. Ресуспендируют и мыть МНК х 3 с фосфат Дульбеко буферном растворе (DPBS) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) х 10 мин, 515 г, до покрытия на два 12-луночных планшетах в полной EPC среднего роста (MCDB-131 среде с 5 мл 200 мМ L-глутамина, 10% FBS и EGM-2 SingleQuots) при 37 ° C, 5% СО 2. Медленно изменение среды каждые 24 часа в течение первых 7 дней, затем через день. EPC колонии могут быть выявлены после среднее время от 14 дней в зависимости от их булыжником морфологии. Как только ЕРС в культуре покрытие четверть 12-а площадью поверхности, расширить клетки и подтвердить EPC идентичность с проточной цитометрии путем проверки на наличие поверхностных маркеровCD31 и отсутствие CD14, CD45, как описано выше 6. Другие тесты, которые могут быть выполнены включает морфологию клеток и маркировка с DII-Ac-ЛПНП. Для проведения экспериментов, описанных здесь, расширить изолированных ЕРС, пока они почти сливающийся в 3-х Т-75 культура клеток в колбах EPC среды в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО 2. 2. Shear расчета стресса Мы рекомендуем, чтобы эти расчеты выполнены до изготовления камеры и канала иметь глубокое понимание условий, которые могут быть достигнуты. Рассчитайте расход перфузат в вашей схеме на основе желаемого напряжения сдвига, которые должны применяться к клеткам в соответствии с уравнением 1 1, где Q является требуемый расход, τ является целевой ыслышать напряжение, действующее касательной на клетки, ш-ширина потока камера, ч-высота проточную камеру, а μ-вязкость перфузат (потока среды). Типичное значение вязкости (μ) для используемой среды составляет 0,9 сП (0,009 г-см -1 с -1). Обратите внимание, что вязкость может быть поднят также при помощи большого молекулярного веса декстрана, по желанию 7. Типичное значение целевой напряжения сдвига (τ), используемые в 15 дин / см 2, (типичный артериальная напряжение сдвига) или 100 дин / см 2, если выше-физиологического напряжения сдвига желательно. Наша камера обычно имеет ширину (W) в 1,9 см и высота (H) в диапазоне 166 – 267 мкм. 3. Производство Поток камеры Отрежьте верхнюю и нижнюю пластины йэлектронная камера из алюминиевого сплава 6061 прямоугольную акции с верхней размерности 7 х 2 х 0,5 "и нижней размеры 7 х 2 х 0,25". Перерыв верхней пластине в центральной части до 0,125 "глубокий, оставляя 0,950" в конце для 1,375 "ширина х 0,3125" глубокий резервуар для жидкости. Дрель 1 / 16 "в ширину х 0,625" длинные слоты от нижней, чтобы проникнуть в резервуар на приток и отток концах. В конце каждой верхней пластине, просверлите в центре города 10/32 "дорожек на дюйм (TPI) отверстие для полипропилена 1 / 8" штуцером для шланга, чтобы проникнуть в резервуар с жидкостью. На приток целью создания сторону вилку 10/32 "ТПИ через отверстие для полипропилена 1 / 8" штуцером для шланга. Конический верхней нижней из жидкости приток окно смотровое стекло на 0,518 градусов для адекватного смешивания жидкости. Вырезать окна стекло в нижней пластины в соответствии с верхнего окна просмотра. Использование аквариума цемент, клей стекло в камеру. Дайте лекарство не менее 24 часов.Убедитесь, что окно просмотра утоплена так, чтобы 75 х 25 х 1 мм стекло микроскопа будет заподлицо в камере. Создать выемкой для уплотнительного кольца вокруг нижней части верхней и нижней пластин, что они находятся на расстоянии друг от друга на 0,02 ". Вставьте резиновые уплотнительные кольца. Дрель 10 соответствующих 8 / 32 "TPI отверстия в верхней и нижней камер для использования с 8 / 32" с плоской головкой. 4. Схема сборки потока Соберите весь кругооборот потоков, а затем приступить к его стерилизации. Прикрепите 36 "сегменте жестких трубы к одному концу импульса демпфера (через 1 / 8" соединение). К другому концу, приложите 18 "сегменте мягких труб. Место 1 / 8 "мужской Luer адаптер в конце 18" мягких разделе трубы, упомянутых в пункте 4.2. Подключите мужчин Луер к 1 / 8 "женский Luer адаптер. Подсоедините гнездовой Luer на новый 18" сегменте мягких труб. Просверлите три отверстия в 250 мл стакан крышкой стеклянной, чтобы соответствовать труб. Явставляйте 1,5 "сегмент мягкой трубки (как вентиляционное отверстие) в одно отверстие и свободные концы жесткие и мягкие трубки через другие 2 отверстия в крышке на 250 мл стеклянной бутылке (в водохранилище) (рис. 2). Убедитесь, что жесткие трубки достигает дна водоема (как отток трубы из резервуара). Стерилизовать выше частей паром в автоклаве при 121 ° С в течение 60 мин. Кроме того автоклаве один полный камере поток, 3 х 2 "сегментов мягких труб, 1 мужчина и 1 женщина 1 / 8" Luer адаптер, 4 х ½ "и 6 х 5 / 16" 8-32 с потайной головкой, 1 пинцет , один 75 х 25 х 1 мм стекло (или другой требуемый материал клеточной поверхности), и 2 хирургических полотенца. Место стерильные полотенца в ламинарным укрытием потока. Место поток цепи, проточную камеру, 4 х 4-х кранов, 1 х 1-путь краном, и все стерилизованные, начиная с шага 4,5 на эту стерильную области. Теперь используйте стерильные перчатки, чтобы соединить два 4-х кранов. Место колпачки на открытые порты образца. </li> Отсоедините мужского и женского Луер адаптеры крепления два мягких сегментов трубки потока цепи и вставить связанные кранами (рис. 3). Прикрепите мягкие трубки вставляется в резервуар 30 мл шприц и удалите шприц поршень. Заполнить бутылку с 125 мл EPC среды (рис. 4). Место стерильный фильтр шприца в вентиляционное отверстие (рис. 4). Перемещение потоков контура в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО 2. Зажим жесткие трубки в голову валик насоса указаны для данного типа труб (рис. 5). Убедитесь, что трубка не перекрывается с роликом для установки насосов треков. Марка трубы, где она выходит из насоса голову на обе стороны с маркером. Убедитесь, что все краны закрыты направились образца порты и открытые вдоль потока цепи. Запустите насос. Убедитесь в направлении потока. Перфузат должны двигаться птом стекло резервуара через трубку в жестких демпфер импульсов. 5. EPC флуоресцентные маркировки В то время как поток схему прогревается до 37 ° С, подготовить клетки для посева на слайде. Обратите внимание, что флуоресцентные маркировки не требуется, если клетки должны быть визуализированы на непрозрачных материалов, например, титана (Ti). Создать 1 мМ исходный раствор сотовый Tracker Orange (КТО) путем разбавления 50 мкг технический директор порошок с 90 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Будьте уверены, чтобы оградить эту смесь от освещенности (выключить свет, работающий под капотом потока). Создайте 2 мкМ рабочего раствора CTO путем разбавления 36 мкл исходного раствора технический директор в 18 мл бессывороточной MCDB-131 среды. Промыть ЕРС в 3 вблизи сливной Т-75 клеточную культуру колбы с 10 мл DPBS (без Са и Mg). Добавить 6 мл 2 мкМ технический директор рабочего раствора в каждую колбу. Инкубируйте в течение 15 мин при 37 ° C. Промыть каждую колбу х 2 по 10 DPBS мл (без Са и Mg). <lя> Добавить 4 мл трипсина в каждую колбу. Инкубировать при 37 ° С в течение 3 мин. Нейтрализовать с 8 мл раствора нейтрализации трипсина. Вымойте центрифугированием х 5 мин при 600g и ресуспендируют в 5 мл среды EPC. 6. Сотовые посев слайд до проточную камеру сборки Слайд сделаны из стекла, титана и других материалов могут быть использованы, и слайд поверхность может быть изменен спина покрытие с добавлением полимера или слой металла. Место скользить в стерильных прямоугольной четырехкамерные культуре клеток сосудов (или использования культуры тканей слайд колбу, если полистирола поверхность желательно). Граф клеток и семян 1,5 х 10 6 клеток на слайд в 5 мл среды EPC х 6 часов, если сливной слоя клеток желательно на начало течения (рис. 11А). Для того, чтобы испытательной камере распространения и адгезии под жидкости напряжение сдвига, позволяющие 3 х 10 6 клеток придерживаться в течение 15 мин до начала потока (быстрого посева) ( <strong> Рис. 11В). 7. Поток сборки камеры Использование стерильных перчаток, подключите один 2 "мягкого сегмента трубы в 1 / 8" женский Luer адаптер. Подключить еще 2 «мягкой сегмента трубы к 1 / 8" мужской Luer адаптер. Приложите 2 "мягкие трубки с внутренней Luer адаптер для притока порта. Установите 2" мягкие трубки с наружной Луер к оттоку порт. Приложите 4-х кранов на оба этих Луер адаптеров. Подключить оставшиеся 2 "мягкий кусок трубы к разъему левого борта сходит пузырь ловушку и прикрепить 1-путь краном (рис. 6). Использование стерильного пинцета, удалить ячейки односемянных слайд с судна клеточных культур (или если вы используете слайд колбу, снимите колбу на слайде) и поместите его в выемку на нижней панели проточную камеру. Убедитесь, что слайд помещается с сотовым посеяны стороной вверх. Внесите 10 мл теплой EPC среды на слайде. Разрешить среда для покрытия слайдов и проточную камеру, бут не проливать среды на уплотнительное кольцо на нижней пластине. Место верхней пластине проточную камеру на нижнюю пластину, совместив отверстия для винтов. Будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха в камеру во время этого шага, сохраняя две пластины параллельно. Винт пластины вместе (автоматическая батарейках отверткой ускоряет этот процесс). Удалить пузырьки воздуха из притока ловушку пузыря, открывая 1-полосный кран прилагается к притоку порта на стороне ловушки пузырь и аккуратно промыть приток труб с EPC среде с помощью 10 мл шприц. Затем закрыть эту кран и крышка его (рис. 7). Теперь удалить пузырьки воздуха из камеры, открыв канал оттока порт 4-ходовой кран и, аккуратно промывки EPC среды, через проточную камеру, опять же используя 10 мл шприц. Если большие пузыри остаются, повысить отток конце камеры под углом 45 ° (рис. 8). Cap всех 4-х соединений крана и закройтеих. Перемещение потоков в камере инкубатора с собранным поток цепи (рис. 9). Пауза насоса контура. Закрыть краны потока замыкание в направлении потока, чтобы предотвратить утечку и держать внутри камеры стерильными. Транспорт проточную камеру от потока капот, чтобы поток цепи. Подключите камеру потока к потоку контура. Откройте запорные краны в направлении потока. Возобновление потока насоса. Убедитесь, что перфузат потоки в правильном направлении. Отрегулируйте расход в желаемое напряжение сдвига. В течение эксперимента, проточную камеру может быть удален из цепи изображений клеток с помощью света или люминесцентной микроскопии. Для того, чтобы сделать это, отключите проточную камеру от потока замыкание на кран-кран соединений. Для поддержания стерильности камеру, закрыть поток схему кранами и кранами проточную камеру в направлении потока и шапку все краны до удаления потока схемаиз инкубатора (рис. 9). 8. Перфузат пробы Для удобства коллекция перфузат образцов для анализа (например, синтеза оксида азота), первая пауза насоса. Закрыть кран расположен ближе всего к демпфер импульсов. Удалить ее защитный колпачок и вставить небольшой шприц размера, например, 3 мл шприц, в образец порт. Держите крышку и убедитесь, что он не будет загрязняться, поместив его с ног на голову. Закрыть кран в направлении потока камеру, держа порт образца и замыкания в направлении импульса демпфера открыта. Нарисуйте нужное количество образца, например, 150 мкл, из схемы. Закрыть кран на образце порт, прежде чем снимать шприц. Магазин перфузат образца помечены флакон и замерзает при – 80 ° С (для азотной определения оксида на более позднем этапе). Отчет образец порта и гарантировать, что все запорные краны открыты до начала потока. 9. Представитель результаты Используя наши быстрого семян методом, человеческой крови полученных эндотелиальные клетки-предшественники могут быть посеяны на титан слайды в течение 15 минут и придерживаться в физиологических (артериальное) поперечных сил от 15 дин / см 2. Как показано на рисунке 10, ЕРС распространение под влиянием потока от 210 ± 11,4 мкм 2, сразу после посева, до 657 ± 39,1 мкм 2 после 3 часов, а до 1152 ± 55,3 мкм 2 после 24 часов жидкости напряжение сдвига от 15 дин / см 2 (разница между группами статистически значимы при р <0,0001, 1-дисперсионного анализа). Параллельно с увеличением область ячеек, которые могут быть отображены через прозрачную камеру с света или флуоресцентного микроскопа, округлость рассчитывается по формуле 2 6 / Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/> снизилась с 878 х 10 -3 ± 5,9 х 10 -3, сразу после посева, до 671 х 10 -3 ± 19,2 х 10 -3 через 3 часа, а до 526 х 10 -3 ± 19,2 х 10 -3 после 48 часов одного и того же воздействия напряжения сдвига жидкости (разница между группами статистически значимых раз при р <0,0001, 1-дисперсионного анализа). Рис 11D показывает, что ЕРС выровнять и сориентироваться в направлении потока после 48 часов жидкости напряжение сдвига на 15 дин / см 2 по сравнению с их случайной ориентацией после статического период посева 6 часов, показанный на рисунке 11А. Наш метод также позволяет получить образцы перфузат в заданные моменты времени для анализа и / или количественного секретируемых метаболитов клетки. Как представитель примере мы изображают производствоТион нитритов (NO 2 -) в ходе 48-часовой поток экспериментировать с свиного ЕРС на рисунке 12. Мы напрямую измерять этот первичный продукт окисления оксида азота (NO) в качестве суррогатного маркера NO в средних проб из потока замыкание на различные моменты времени, чтобы быть 12,0 нмоль на 6 часов, 13,1 нмоль на 12 часов, 16,3 нмоль на 24 часов, и 24,6 нмоль после 48 часов 1 х 10 6 клеток на 15 дин / см 2 6. Рисунок 1. Схематическое изображение обзор сборки потока цепи и поток эксперимента. () Расход схема сборки без проточную камеру. Сюда входят водохранилища, пульс демпфера, жесткие трубы, мягкие трубки, 4-краны и связанные Луер адаптеров, а также воздушный фильтр. (В) Подключение через проточную камеру жесткий сегмент трубы по голове насоса. (C) В утверждении, о EPC-посеян скользить в нижнюю часть потока камера (D). Полная сборка потока цепи с проточную камеру. Рисунок 2. Полностью собранный поток схему для стерилизации. Рисунок 3. Собранные поток цепи после стерилизации с кранами включены. Рисунок 4. Заполнение стекло резервуара с 125 мл среды EPC. Рисунок 5. Поток цепь зажимается в голове насоса до поток вставки камеры. JPG "/> Рисунок 6. Вернуться к началу сборки пластины камеры. Рисунок 7. Промывка пузырь ловушки со средним EPC, чтобы удалить пузырьки от притока сторону камеры. Рисунок 8. Промывка камеры со средним EPC, чтобы удалить пузырьки из слайдов и отток сторону камеры. Рисунок 9. Полностью в сборе потока цепь со вставленной проточную камеру во время поток эксперимента. Рисунок 10. EPC площадь (в мкм 2) увеличивается с течением времени ход потока эксперимента. files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/> Рисунок 11. () Легкий изображения микроскопа HUCB ЕРС посеянных на фибронектин покрытием предметное стекло х 6 часов до потока при 100-кратном увеличении. (B) HUCB ЕРС помечены технический директор и быстро посеяны на слайд Ti х 15 мин до потока, визуализируются с флуоресцентной микроскопии при 100-кратном увеличении. (C) и тот же слайд Ti с ЕРС HUCB как под (Б), через 3 часа потока на 100 дин / см 2 и отображение через прозрачную камеру при 100-кратном увеличении. Обратите внимание, распространение клеток, но все еще случайную ориентацию через 3 часа потока. (D) и тот же слайд Ti, теперь, после 48 часов поток экспозиции при 100-кратном увеличении. ЕРС помечены технический директор и ядра клеток окрашиваются красителем Hoechst с (синий цвет), после потока. Обратите внимание на выравнивание ячеек в направлении потока. (E) Свиной ЕРС для сравнения на Ti после 48 часов поток и 15 дин / см <sup> 2 сдвига воздействия стресса. Сотовые границы были окрашены анти-PECAM пятна (зеленый) и ядер с Sytox оранжевой нуклеиновых кислот пятно. Обратите внимание на выравнивание ячеек в направлении потока. Рисунок 12. График изображает НЕТ производству ЕРС свиней в течение 48 часов после потока. Первичный продукт окисления NO, нитриты (NO 2 -), была измерена в качестве суррогатного маркера для NO от средней пробы в различные моменты времени в течение потока. Рисунок 13. Потоком камеры выполнен из алюминиевого сплава 6061 прямоугольную акций с верхней части (А) соответствует 0,5 "х 2" х 7 ", а нижняя часть (B) 0,25" х 2 "х 7" в размерности. ВершинаПланируется на его нижней стороне уплотнительного кольца контактной поверхности до 0,45 ", чтобы застраховать плоскостности для герметизации. верхняя часть утоплена в его центральной части до 0,125", что оставляет 0,95 "в конце для 0,3125" х 1,375 "резервуар для жидкости. водохранилища верхней секции с резьбой 3/8-24 ТПИ и 0,25 "глубоко, чтобы получить резьбовые пробки из нержавеющей стали. Слоты измерения 1 / 16 "х 0,625" были обрабатывается в нижней, которые проникают в резервуар. Плагин приток сторона 10/32 "через отверстие для полипропилена 1 / 8" штуцером для шланга для подключения к краном. Каждый блок имеет конца центре города резьбовых 10/32 TPI на 0,25 "глубокую часть для полипропилена 1 / 8" штуцером для шланга в 0,45 "х 2" конца. Концы использовать 0,07 "дыру в нижней части нити через проникнуть в резервуар. Нижней верхней части имеет коническую область 0,6875" широкий, 0,518 градусов от центра слот LH на расстоянии 1,460 ". Этот конус смесей для плоской области 0,6875 "ширина х 0,0118" глубокий и 0,590 "с конца Glasс (или другой поверхности, например, слайд титана) перерыва. Эта квартира должна быть на одном уровне с стекла (или другой поверхности, например, титана слайд), как только слайд установлен. Конических и плоских полируются. Поверхность слайд 0,0118 "встраиваемые от нижней поверхности. 0,0118" перерыва продолжает водохранилище слот RH конца. Уплотнительное кольцо утоплена полностью вокруг слотов и слайд оставляя 0,020 "оригинальных поверхности между уплотнительным кольцом паз и слайдов. Верхняя и нижняя единиц сверлятся в течение десяти отверстий. Верхняя часть имеет сквозными отверстиями для 8 / 32 TPI потайной плоской головкой. Нижняя секция имеет отверстия размещены соответствующие верхние отверстия и резьбовые 8 / 32 TPI. дно блок имеет четкую стекло окна встраиваемые заподлицо с ее поверхностью расположена над стеклянной поверхности клетки слайд (или титана слайд). единицу имеет уплотнительное кольцо, которое охватывает паз слота верхнего блока с шириной оставить 0,04 "оригинальных поверхности между слайд дно и внутреннюю уплотнительное кольцо паз. О-ринGS красные силиконовые AS568A, Dash Количество 044 для верхней части и 046 для нижней части.