丰富的少突胶质细胞培养和Myelinating产后小鼠组织联合培养的少突胶质细胞/神经元的推导

伦理声明 根据加拿大动物保健理事会（廉政公署）的指导方针，在这项工作中所使用的小鼠照料。获得批准的，从渥太华动物保健委员会根据协议号OGH – 119大学进行实验的伦理。 1。夹层 – 为OPC提取新生小鼠皮层根据机构指引牺牲P0 – P2的鼠标。 解剖一个Petri菜含有冰冷MEM（不含抗生素）的大脑和地方。 盘转移到解剖镜下。 用脑背侧使用手术刀，使浅切口弧矢沿每个皮层（图1A）最内侧的边缘。这个切口应该只通过脑膜层，以促进其清除。 用细尖的镊子，以横向的方式脑膜剥离。如果做得仔细，这一层可以删除在一块。在这一步，去除嗅球。 随着大脑的腹侧方的，作出了深刻的矢状切口皮层与间脑的腹侧区（图1b）。 随着脑的背侧，撬在内侧横向时尚（图1C，C'）的组织分开的脑皮层。在这一步中删除任何剩余的脑膜。 骰子成每个约4件，轻轻地转移到15 mL锥形管内含有350μL的MEM每鼠脑皮层。管置于冰上，直到所有的老鼠都被处理。 余下的小鼠重复步骤1.1-1.8。 2。解离新生儿皮质和胶质混合文化的维护注意：应避免在以下所有步骤的气泡成细胞悬液。 添加15毫升的锥形管中，37℃水浴3分钟的新鲜解剖大脑。 大脑转移到无菌组织培养罩。 泡皮层轻轻地穿过一个P1000的枪头，以产生更小的片段。一旦有大到足以破坏一个畅通暂停通过枪头无脑片停止吹打。 添加到锥形管75μLOPC木瓜每大脑的解决方案。 OPC木瓜蛋白酶溶液必须预先加热37 ° C为前20分钟使用。 孵育在37℃水浴20分钟。大约每2分钟，轻轻颠倒管，以防止组织聚集。在此期间，每个聚- L -赖氨酸（PLL），涂（1毫克/毫升）的T25的瓶（小鼠大脑中的每一个瓶），并在37℃组织培养孵化器放置在添加5毫升混合胶质文化传媒8.5％的CO 2。 20分钟后，返回的组织悬液无菌罩和管加入2毫升每脑胶质混合培养基。让我们坐下来让灭活OPC木瓜蛋白酶溶液在室温为10分钟。 分装成5毫升塑料管的组织悬液。管的数量应匹配的解剖大脑，造成约2.5毫升每管。 使用无菌火焰抛光玻璃巴​​斯德吸管，轻轻磨碎每管组织。起初慢慢磨碎，并逐渐增加速度块游离。磨碎约10-15倍，但这个数字可能会有所不同的基础上消化的功效。 注：根据trituration将导致贫困的组织分解，而过trituration将产生不利影响细胞活力。重要的是不引入到解决方案中的泡沫，因为这将严重影响细胞活力。 一旦有不可见的组织团块，留在暂停，转移到50 mL锥形管中含有4毫升每脑胶质混合培养基（即4大脑= 16毫升混合胶质文化传媒）。 轻轻翻转50 ml锥形管和重复余下的5 mL管。 汇集的细胞悬液，分装成15毫升的锥形管（大约6.5毫升每15毫升管）。 15毫升管的数目应相匹配的解剖大脑。 离心管在1200转5分钟（约300克）。 小心吸出上清液，加入1毫升的温暖混合胶质文化传媒，每次15 mL锥形管。 慢慢地重新悬浮颗粒与P1000的枪头，小心，不要引入气泡。加入细胞悬液，每管预平衡PLL涂层的T25烧瓶，呈现总量的文化传媒至6 ml。 放置在3-4小时的组织培养孵化器的烧瓶中，让细胞附着到PLL基板。吹打媒体，并加入6毫升新鲜混合胶质细胞培养基的烧瓶执行一个全媒体的变化。这一步的碎片删除造成的trituration，并促进文化的生存能力。如果OL / DRGN联合培养的需要，是指本议​​定书第3条。 经过3天的文化，执行删除媒体4毫升，4毫升新鲜混合胶质培养基代替2 / 3的介质改变。在这一点上，星形胶质细胞的单层应在烧瓶底部形成。 第6天，进行2 / 3的媒体的变化和与终浓度为5μg/ mL的胰岛素补充的烧瓶。在这一点上，星形胶质细胞的单层应清晰可见，其中OPCs的将增殖的顶部。 3。 DRGN隔离注意：要产生OL / DRGNs联合培养，DRGNs应建立后，胶质混合文化生成一天。这两种文化类型的种植独立，合并后9-10天。 牺牲P5 – P10鼠标根据机构指引。 提取脊柱，并转移到一个干净的培养皿。 修剪，尽可能的脊柱（图1D，D'）尽可能多的肌肉和骨，因为这将缓解解剖背根神经节（病种付费）。 修剪脊柱转移到一个新的培养皿腹侧，。使用夹层剪刀，从尾端开始，穿过脊柱内侧在纵向的方式。 使用两个双钳，轻轻撬开脊柱脊髓暴露。 病种付费，可以发现下方和外侧脊髓。用细尖镊子，轻轻取出病种付费，同时避免损害神经节（图1E）。 将去除病种付费冰冷汉克的缓冲盐溶液（HBSS中，无抗生素）在一个新的培养皿。剥离的目标应提取40％小鼠背根节（图1F）。 已提取的病种付费后，修剪任何过长的根（图1G，G'）的病种付费，以尽量减少污染细胞引入到文化（神经胶质细胞，成纤维细胞）。 病种付费转移到1.5 mL离心管中，含有500μL冰冷的HBSS。 离心机在1200转（约300克）5分钟，4 ° C至颗粒的病种付费。 离心管转移到无菌组织培养罩，从管道中删除的HBSS。 加入500μL预热（20分钟在37 ° C）DRG的木瓜蛋白酶的解决方案，并在37℃水浴10分钟中孵育管。反转管每隔2分钟，以防止组织聚集。 重复步骤3.10。 取出DRG的木瓜蛋白酶溶液，并添加500μL预热胶原酶一个解决方案，在37 ° C（20分）。在37℃水浴孵育10分钟，反相每2分钟。 重复步骤3.10。 去除上清液，加入1毫升DRGN媒体。反转管好几倍。 重复步骤3.10。 重复步骤3.16。 外套无菌火焰抛光玻璃巴​​斯德吸管吹打的HBSS几次0.25％BSA溶液与牛血清白蛋白（BSA）的。 BSA溶液的涂层将坚持的玻璃吸管的墙壁防止病种付费。 与BSA的涂层吸管轻轻磨碎的病种付费，在第一，和强度的增加，一旦团块开始游离。磨碎约10-15倍，但是这个数字是依赖于一定程度的消化，每管病种付费。 一旦实现了分解，通过一个50微米过滤到无菌的Petri菜含有7毫升DRGN媒体的暂停。过滤将消除碎片从细胞悬液，尽管这一步并不重要。 8.5％的CO 2孵育培养皿约1.25小时。 大衣几个12毫米盖玻片，用液氮在24孔盘（10微克/毫升的PBS）在此孵化时间。 一旦孵化完成后，观察培养皿中，在明亮的领域。被确定为大型健全，相黑暗的牢房DRGNs。摇动培养皿轻轻地抬起任何坚持DRGNs。 注：许多污染细胞会强烈坚持的培养皿中，从而丰富DRGNs细胞悬液。 细胞悬液转移到15 mL锥形管。轻轻冲洗4毫升DRGN媒体的菜收取任何残留DRGNs。将附加的4毫升的锥形管。 离心5分钟1200转（约300克）。 吸上清，沉淀重悬在500μL新鲜DRGN媒体。 计算取得DRGNs使用血球数量。请务必只DRGNs，而不是其他类型的细胞计数。 DRGNs可以识别他们的大球形细胞机构。 种子30,000-50,000 DRGNs在8.5％的CO 2一夜之间每1毫升DRGN媒体液氮涂盖玻片，在37℃组织培养箱内培养。 第二天早晨，富于变化的介质更换DRGN执行媒体与媒体与终浓度为1％笔/链球菌和10μmolFUDR的OL（减去，CNTF）。 第3和第5天，执行一个相同的媒体与步骤3.30 3 / 4媒体的变化。 第7天，进行全媒体与媒体（减号，CNTF，PEN /链球菌，FUDR）OL变化。 在第9天，DRGNs应该已经形成了一个广泛的突起床，现在已经准备好要与OPCs的共同培养​​。 4。 OL丰富的文化或OL / DRGN合作文化的建立混合胶质细胞培养纯化的OPCs 胶质混合文化的第9天，将烧瓶在5％的CO 2组织培养孵化器的轨道摇床。空T25烧瓶上放置的烧瓶，防止造成负面影响的混合胶质文化的轨道摇床所产生的任何热量。允许文化的平衡1小时，这个新的孵化器。 一旦烧瓶平衡，摇匀，在45分钟50转的烧瓶。这动摇的目的是消除任何松散附着的污染从单层细胞。 移动细胞到组织培养罩，从烧瓶中删除所有的媒体。更换4毫升新鲜混合胶质文化媒体与5μg/ mL的胰岛素补充。 将振动筛返回到烧瓶，并允许以平衡为大约3小时。 一旦烧瓶是平衡的，他们牢固地拧紧的轨道摇床，摇烧瓶，在220 RPM（过夜）约16小时。 第二天早晨，如果在DRGNs的情况下（ 即 OL丰富的文化），大衣几个无菌液氮（10微克/毫升的PBS）1小时12毫米盖玻片种植OLS。 24菜肴转移的盖玻片，用PBS冲洗，随后一个洗OL媒体。每孔加入1毫升的OL媒体和平衡在8.5％的CO 2。 在5％平衡30分钟10厘米的组织培养皿CO 2。每2烧瓶，将需要一盘。这些将用于附着力差的悬浮OPCs的富集。 一旦平衡时间已经过去了30分钟，动摇烧瓶转移媒体的菜肴。每一道菜，应该得到2烧瓶媒体，相当于每10 cm培养皿的细胞悬浮液约8毫升。 孵育5％CO 2 30分钟的菜肴，同时提供了在15分钟大关的温和的微调。这种微调，将有助于防止坚持10 cm培养皿OPCs的。 一旦孵化完成后，检查的菜肴，在明亮的领域。 OPCs的被认定为小细胞团块，通常3-5个细胞，但有时会形成类似神经球的大聚合。许多非OL系细胞，应坚决坚持的板块基地。轻轻旋流板分离任何松散坚持OPCs的，并从每个板块转移到15 mL锥形管的细胞悬液。 在1200转（约300克）离心5分钟。 1毫升的OL媒体与一个P1000的枪头，随后再悬浮与P200的枪头重悬沉淀。 使用血球计数细胞。 对于丰富的OL文化，种子25000 – 50000 OPCs的每12毫米液氮涂在终体积为1 mL的OL媒体盖玻片。 适合OL / DRGN联合培养，从第DRGNs执行一个完整的OL媒体（减去，CNTF）的变化[3]，并轻轻地增加50,000从OPC富集细胞悬液细胞。请小心不要破坏DRGN突起床期间增加的OPCs。 广场文化，在37℃孵化器在8.5％的CO 2，避免删除，直到固定。小鼠OPCs的敏感，pH值的变化，从孵化器中删除，将改变的OL媒体的pH值。另外值得注意的，除了周围的细胞培养的空 ​​井DH 2 O将防止培养基蒸发，从而最大限度地减少浓度的溶质的波动范围内的OL媒体。这将提供一个更一致的OPCs的的环境。 5。处理免疫荧光显微镜文化在-20 ° C，100％甲醇为10分钟，或3％多聚甲醛在室温为15分钟，修复文化。 通透盖玻片0.1％TRITON – X – 100的10分钟，冲洗1小时10％山羊血清磷酸盐缓冲液（PBS）和块。 原发性抗体孵育盖玻片在封闭液过夜稀释在4 ° C 洗净的盖玻片，用PBS 3倍，并培育与Alexa的福陆公司共轭二次稀释抗体阻断45分钟的解决方案（Invitrogen公司）。 4',6 – diamidino – 2 -苯基吲哚（DAPI）染液，用PBS冲洗盖玻片几次。 DAKO公司荧光灯安装在盖玻片安装介质。 通过免疫荧光显微镜分析的幻灯片。在这个协议中，幻灯片一个ZEISS AXIOVERT 200M倒置荧光分析显微镜或蔡司LSM 510 META激光扫描共聚焦显微镜。 6。全细胞蛋白提取OL丰富的文化从孵化器和冷却，冰浴3分钟，取出24以及文化。 小心取出媒体，并添加10-20μL裂解液（50毫米的Tris – HCl，150 mM氯化钠，0.1％SDS，0.5％去氧胆酸钠，1％TRITON – X – 100，用0.1％的胃酶抑素，抑肽酶，PMSF，亮肽素，钒酸钠），每孔（至少8％的样品水井的建议）。 使用大口径的P1000的吸头，刮井和裂解液转移到1.5 mL离心管。 穿过30轨半注射器裂解约15倍，上冰30分钟的寒意。 14,000 RPM（〜20,000 G）为15分钟在4 ° C离心管传输上清至新的离心管中，并储存于-80 ° C。 7。 SDS – PAGE分析在丰富的OL文化蛋白质经SDS – PAGE降低标准的12％聚丙烯酰胺凝胶的缓冲解决每个样本中的蛋白质30微克。 半干转移到PVDF膜凝胶。 1小时座膜在TBST在5％脱脂奶粉（10毫米的Tris – HCl pH值8.0，150 mM氯化钠，0.1％Tween – 20的）。 孵育膜与稀释的抗体阻断1小时的解决方案。 10分钟TBST洗膜3次。 HRP标记的二抗封闭液为45分钟的孵育膜。 用TBST洗膜几次，Amersham公司的ECL Plus Western印迹法检测试剂（通用电气医疗集团）孵育5分钟。 检测标准的科学成像胶片蛋白条带。 8。代表性的成果： 在这个协议中，OPCs的是扩大单层星形胶质细胞内胶质混合文化。这是来自P0 – P2的新生小鼠皮层神经胶质混合文化。每日1 次，在体外（DIV1），胶质混合文化包含不同形态的细胞相衬显微镜（图2a）。在DIV3，星形胶质细胞的单层烧瓶的基础上开始形成，并在DIV8时，OPCs可以清楚地观察单层表面上。在DIV9，增殖的OPCs的已达到足够的密度，一夜之间高速轨道晃动纯化。一旦纯化过程已经完成，其结果是一个OPC丰富的细胞群。 DIV1后净化时，OPCs有简单的形态，延长几道工序（图2b）。在DIV3后纯化，细胞有延长一个复杂的过程小梁，让人联想到不成熟的OLS。在DIV6后的净化，纯化的OLS已夷为平地，预计单张般的膜结构。这种形态的发展是典型的体外成熟OLS 。 OL系（图3a）表明纯化的细胞免疫荧光显微镜。种子OPCs的最初表达的硫酸软骨素蛋白多糖（NG2），并发展成髓鞘相关糖蛋白（MAG）积极不成熟OLS后三天内播种（图3B）。在DIV6，很多OLS表达髓鞘碱性蛋白（MBP），并具有典型的成熟OL形态。 ％的OL系的细胞在不同时间点进行了量化，以确定纯度的OL丰富的文化（图3C）。在DIV1后的净化，文化为50 ± 14％NG2 +已经OPCs的，没有MAG + ve或MBP +已经OLS 。这表明OL系细胞的纯化是有区别的OLS可以忽略不计的数字，在播种时在易制毒化学阶段。在DIV3，许多OLS分化成MAG +已经细胞（24 ± 5.9％），而一些保留的易制毒化学表型，并保持NG2 +（13 ± 8.0％） 。在DIV3，MAG +已经细胞（3.2 1.2％）的比例很小，也表达的MBP。在DIV6，20 ± 5.9％OLS MAG +已经 12 ± 7.3％，而坚持NG2 +已经 OPCs的。此外，21 ± 9.3％的细胞内的文化是MBP + VE在这个时间点OLS 。 SDS – PAGE分析显示分级2'3' -环核苷酸的3' -磷酸二酯酶（CNP）在6天的文化时期的MBP表达，进一步体现了文化OPCs的的能力末期分化成成熟的OLS（图3D ）。总的来说，这些数据建立了这种方法生产OL丰富文化系统适合从OPCs的OL成熟的研究手段。 该协议还介绍了建立OL / DRGN联合培养，使用只鼠的组织来源的方法。然而，以产生共同的文化，DRGNs必须先单独培养，以产生足够的突起网络。这些产后小鼠神经元的文化是生长在低血清媒体9天与10μM的FUDR补充，以防止污染成纤维细胞增殖和GL胶质细胞。在9天的体外过程中，孤立的DRGNs产生一个致密突起的床（图4a ）。这突起的床是免疫阳性神经元的标志物神经丝蛋白200（NF）和Tuj1（图4b）。此时，纯化OPCs的可能是添加的突起病床，和一个额外的6天生产myelinating联合培养培养。 在DIV6 OL / DRGN合作文化，很多的MBP +已经 OLS可以观察之间的NF +已经 DRGN突起（图5a）。经仔细检查，OLS证明，使众多DRGN突起的联系，经常鞘的MBP +已经膜（图5B，C） 。 图1。特别是新生小鼠皮层和背根神经节隔离方面的解剖显微镜图像。 （一）背视图新鲜提取的新生小鼠大脑。虚线表示切口必须作出便于去除脑膜层的面积。（二 ）脑腹面观，虚线表示皮层符合腹间脑的地方。深的切口，必须沿虚线援助隔离的皮质（C – C'）的可视化描述如何撬从脑的其余部分的皮质（D）一个新鲜分离的P5 – P10鼠标脊柱之前修剪走多余的肌肉和骨骼（D）（E）在脊柱病种付费的位置。（F）（G）应该从一个鼠标隔离病种付费的大致数量。一个背根神经节，需要很长的根修剪前酶消化。虚线应修剪根部的区域。（G'），DRG的后根修剪。 图2。 OPCs的是扩大内部胶质混合文化，纯化，并随后作为OL丰富的文化区别 。 （一）第一阶段混合胶质文化对比度的图像，在不同的发展阶段。在DIV1，细胞出现几个扁平细胞轮。胶质混合文化的分层开始DIV3，星形胶质细胞形成一个统一的容量瓶中，赖以OPCs的增殖基地单层。许多OPCs的DIV8坚持的星形胶质细胞单层的表面（箭头），（b）一旦混合胶质文化纯化，DIV1 OPCs的扩展只有几道工序。在DIV3，细胞延长了许多过程，让人联想到中间阶段OLS。在DIV6，夷为平地的OLS（星号）显示有张膜（虚线）。比例尺，50微米。 图3。 OL丰富的文化表征。 （一）的共聚焦显微镜图像的隔离OLS在不同的发展阶段。 NG2 +已经 OPCs的简单形态，而MAG +已经 OLS拥有多种乔木进程。 MBP +已经 OLS延长膜的髓鞘像张。 （二）比例尺，50微米。纯净的OL系细胞的来源称作OPCs，并分化成MAG + VE，MBP +已经OLS超过6格。在DIV1，所有OPCs的NG2 正极 ，而没有MAG + ve或MBP + VE。在DIV3，MAG + ve和少数的MBP +已经 OLS现在很明显的。 OLS的大部分DIV6，MAG和MBP +已经在所剩不多的NG2 +已经 OPCs的。 （三）比例尺，100微米。平均％OL细胞系在不同的发展阶段，超过6格值± SD 。在DIV1，所有的OL系细胞NG2 + VE，占50 ± 14％的总细胞内的文化。 DIV3和DIV6，OL系细胞分别占36 ± 6.8％和32 ± 8.4％的细胞总数，包括不同比例的NG2 +已经 MAG + ve和MBP的+已经 OLS。（D）SDS – PAGE电泳进行从丰富文化展示超过6 DIV文化时期分级OL标记CNP和MBP表达OL源性蛋白。 图4。表征DRGN文化预OPC播种。 （a）第一阶段在9 DIV文化时期前OPC播种DRGNs对比度的图像。 DRGNs起源体型大细胞与几道工序，并产生一个日益复杂的突起网络。比例尺，100微米（二）固定在DIV9（预OPC播种）和神经元特异性标记Tuj1和NF200染色DRGN文化的共聚焦图像。 DRGNs已经产生了突起网络赖以OPCs可能是种子生产OL / DRGN myelinating联合培养。比例尺，50微米。 耳鼻喉科“> 图5。 OLS共培养DRGNs OL介导DRGN突起的MBP +已经膜包装的结果 。 （一）一个4场共聚焦图像蒙太奇一个DIV6 OL / DRGN共培养。许多的MBP +已经 OLS可以看出，与底层的DRGN突起床交互。比例尺，100微米（B）放大的共聚焦视图的MBP +已经 OLS包装多个DRGN突起。比例尺，50微米（C）（b）凡 DRGN突起正在OL膜包裹地区的“数字放大倍率表示。比例尺，25微米。