癌症干细胞迁移的使用进行划分的微流控芯片和活细胞成像的评价

1。 BTSC的细胞分离标志物：BTSC来自生长在无血清干细胞培养基中作为神经球的预先存在的文化。文化其中预先描述10，11。 准备细胞悬液从BTSC衍生的神经球。 BTSC-衍生的神经球被收集在一个15毫升锥形管，离心5分钟，在900 rpm的转速下。更快的离心剪切和/或损害的神经球。吸去上清液和的神经球的文化再悬浮在0.5毫升预热的Accutase。孵育5-10分钟，此溶液在37℃下使松开的神经球。机械破碎细胞，用10-20温柔笔划的P100移液器1.5毫升干细胞培养基，然后加入到细胞中的Accutase。 的标志物：BTSC在1300 rpm离心5分钟，然后离心，并再悬浮在1毫升干细胞培养基。 A 50微升等分试样从suspens删除离子和放置到一个离心管中，进行细胞计数。 50μl的台盼蓝的Eppendorf管中，并添加到该悬浮液被放置在血细胞计数器进行细胞计数。 细胞计数后，如果需要，额外的干细胞培养基中加入的BTSC悬浮液，得到细胞密度为20000个活细胞/微升媒体。 2。双向层状苏-8主站和PDMS印章成型（参见图1）的制备我们使用光学光刻和软光刻技术制作SU-8主站和PDMS印章，这是必不可少的微流体装置的装配。稍有不同的标准程序12，SU-8主是由两层组成。 3微米高的微通道浇铸在第一/底部层前面的过程中，而250微米高的播种和接收腔中的第二/上层。为了两个文化室（微之间的连接是否正确s和腔室），这两层都必须准确地对准的位置。然而，第二层的厚度和不透明度是大到足以阻止基准/光学对准器从访问的底部功能。在这里，我们设计的面具与基准标记远程定位。因此，在第一层中的这些标记物可以被有选择地屏蔽，而第二层的纺丝。其结果是，两个功能层是由在一个主站和准备用于模制在浮雕的PDMS印章。 设计和准备两张照片口罩。一个掩模由两个基准标记和用于第一层的微通道的阵列（长400微米，宽和10-50微米）。另一个掩模由播种和接收用于所述第二层的腔室（2毫米长和宽为600μm）。这两个掩模设计在Illustrator（Adobe公司，加利福尼亚州），激光印刷到透明薄膜（薄金属零件，科罗拉多州），用异丙醇和空气干燥清洗。 使第一层与SU-8的光刻胶（MicroChem，马萨诸塞州）根据供应商的产品使用说明书。首先，旋涂的手柄的su-8（5），与3-μm厚的光致抗蚀剂的晶片（WRS材料，加利福尼亚），然后通过软烘烤。然后，光致抗蚀剂是紫外线曝光和固化后烘烤和显影，接着与相应的掩模紧密接触。 旋涂用250微米厚的苏-8（2100）的第二层。为了防止厚的光致抗蚀剂的阻塞状态，从第一层的基准标记时，我们用透明胶带覆盖这些区域之前，所述第二层的旋涂。磁带，然后剥离，以显示标记的对准目的。 紫外线暴露所述第二层与所述第二掩模。的对准标记显示，它是直接将它们对齐在使用光掩模对准第二掩模的。第二层的光致抗蚀剂，然后紫外线曝光和固化在紧密接触，然后由后烘烤和显影。/ P> 抗粘涂层，导致主。为了帮助去除固化的PDMS，SU-8主可以通过气相沉积，使表面不沾涂层的硅烷化处理。简单地将其放置到一个干燥器中的至少一个小时，与几滴三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷的溶液在真空下。 模具PDMS主。混合预聚物基地和的PDMS SYLGARD的184（道康宁，密歇根州）的比例为10:1彻底治疗者。将其放置在干燥器真空脱气看到，直到没有气泡。混合物倒入的面具，脱气，如果再引入新的气泡。固化在模具上的水平加热板上于90℃2小时，冷却至室温后，轻轻放开PDMS印章。因此，培养渠道刻在PDMS，并准备好组装的设备。主是可重复使用的成型，直到它被损坏或磨损。抗粘涂层，需要时，再次进行的粘性恢复。 3。大会的微流体装置和细胞培养（图2） 为了培养细胞，特征刻PDMS印章附着的玻璃盖玻片上，以形成封闭的通道。入口和出口被创建加载文化/媒体。同时，清理和其他程序，以在玻璃衬底和PDMS印章是必要的，以确保细胞兼容性。 水库通过PDMS印章使用活检打孔器。我们选择其直径为6毫米。这些水库有两个目的服务。一是要保持额外的营养细胞的生长。另一种是移液器装载和真空抽吸的访问。 PDMS印章在70％的乙醇浸泡30分钟，然后用清水冲洗用去离子水，再过10分钟。其目的是为了清除潜在的有机残留物，介绍了在制造过程期间，和未交联的聚二甲基硅氧烷污染。更激烈和彻底的清洗过程，如有机提取13 </sup>和索氏提取14用于其他地方。然而，我们发现是BTSC文化的不必要的。 消毒用高压釜（121℃，35分钟）的PDMS印章。这一步完成的聚二甲基硅氧烷交联反应。从这个步骤开始，直到步骤3.6中，所有的程序都是在无菌方式。 PDMS印章然后放在玻璃盖玻片，预先涂有聚-L-赖氨酸，然后15-17的移动设备与层粘连蛋白涂覆填充与层粘连蛋白的溶液中过夜，在37℃下的信道层粘连蛋白被吸入从设备，该设备是用干细胞培养基。 将细胞悬液从第1步到水库和渠道。 11μl的游离细胞被放置在一个播种储层。使用真空抽吸到播种室迫使细胞，如果需要。增加7微升的细胞都放在的相邻的播种水库。注意：一般的细胞密度为20000细胞/微升媒体。船尾呃五分钟，播种和接收水库充斥着媒体。 将一个0.5毫米的前顶部蒸压的PDMS表上。自然发生的表面粘附2 PDMS件之间的密封的细胞培养和准备运输，孵化和显微成像。 4。长期时间的推移成像的BTSC迁移与BioStation IM（尼康仪器公司，梅尔维尔，USA），。 结合摄像头，在一个盒子里的所有软件和孵化器，这显微系统使图像细胞培养无干扰数天。此外，其独特的电机设计物镜的移动，并保持固定在样品台访问点功能。这使得它实际的图像并行实验和跟踪在高通量检测细胞运动。 预平衡的Biostation IM 45分钟以稳定的温度，水分和空气的供应。此外，一些水续ained菜肴样品室是用来保持适当的湿度。 装入的移动设备中的细胞显微镜的样品室中，和中心使用微型镊子。 的焦点，位置点和时间点Biostation软件设置和启动时间的推移。 5。代表性的成果： 目视检查和表征的癌症细胞的迁移通过使用进行划分的微流体装置的实施例在图3和图4中示出。细胞线是BTSC。我们目前的体制，细胞培养相图像，可以连续记录长为5天（图3）和频繁，每2秒（图4）。超过5天的营养补充和废物排出，文化传媒需要更换。我们的长期时间的推移，在其迁移的形态变化的基础上，确定了循环序列的6个细胞的阶段。作为出版于trated在图3中，我们描述（一）迁移前，（二）开始，（三）路径探索，（IV）巡航，（V）的目标exloration和（六）迁移后。在接收室，梭形细胞停留在阶段（i）在大型的肿瘤，是无法生长，分裂和逐步迁移。他们的做法是微通道入口，一些细胞开始阶段（ii）当他们扩大并产生粘结突出。其中之一是能够占据的入口和进行阶段（iii），这可以探索的迁移方向。一旦细胞决定的迁移方向，它的收益阶段（四）通过微巡航的稳定和高速，这是在整个微。在结束阶段（V）接收室，探索开放式的空间，然后到舞台（六）微通道，细胞的收入。微通道中，迁移能力主要是产生通过出泡活性，如在图4中示出，类似于变形虫大公升。细胞皱缩和膜变形完全记录在这里。 图1的微流体设备的制造示意图。通过修改后的软光刻技术的整个过程进行了一块3英寸的硅处理晶片。作为在第一层是由3微米高的微通道和对准标记。然后250-μm厚的su-8是旋涂，而对准标记用透明胶带覆盖，使得它们可以购买访问屏蔽由厚的光刻胶不挡视线对准。因此，腔室的功能可以作为第二层，精确对准的第一层。 PDMS印章最终成型产生的主。 图2的移动设备的组装和细胞接种过程的示意图。随信附上的PDMS和gl屁股盖玻片，3D培养空间室，水库和微通道组成的。与细胞培养的播种室充满，而接收腔室中最初填以无细胞介质。微通道，它们之间的连接提供细胞迁移的足迹从播种端至接收端。 图3。BTSC通过微转移。上部：快照的时间推移示出超过400微米的迁移从播种侧到接收侧的单个单元格（高亮显示为绿色）。整个行程大约需要2天，涉及一系列的细胞形态学变化。比例尺是40微米。下：六个迁移阶段的卡通表示。预迁移（ⅰ）：在播种室，纺锤状和可分割的细胞逐渐沿相互迁移。微通道入口附近种族相互细胞，分化细胞体和电子 xerting片状伪足突起。启动（二）：最高容量的迁移细胞占据了通道入口，而其竞争对手将撤退。路径的探索（三）：小极性的变形虫模式的迁移细胞的变化。这种迁移方式非常能动的，并能在各个方向上的探索路径，皱缩的小膜突起。巡航（ⅳ）：细胞的迁移路径一旦被确定，变换成一个适于变形虫模式维持一个额外的大突起标题向前。通过这种方式，细胞坚持高的蠕动，以及作为一个稳定的方向和速度。目的地探索（V）：在路径减慢，细胞和，探索接收室的任何侵略目标发展filopodias。迁移后（ⅵ）：进入接收腔室后，细胞变成星形和保持高的蠕动，但没有确定的方向。 “/> 图4。快照时间推移显示出泡一个BTSC活性和膜的变形：（AB）的周期。开始（BD）。扩展;（DF）。回缩。和曲线线的箭头表示的方向和位置的膜变形，分别。快照收集每8秒。