Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem
Summary
Bu makale, embriyonik deri ve timüs kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Fonksiyonel bir damar ağının kurulması organogenez önemli bir parçası olduğunu ve optimal organ fonksiyonları için gereklidir. Örneğin, timüs uygun damar oluşumu ve dokusunda organ ve çevre için olgun T-hücresi çıkışında içine timosit giriş için gereklidir. Timus kan damarlarının mekansal düzenleme yerel mikroçevrede, yani timik epitel hücreleri (TEC) gelen sinyalleri bağlıdır. Birkaç yeni raporlar timus damar kusurları 1,2 bu sinyallerin sonuçları bu bozulma göstermektedir. Önceki çalışmalarda yenidoğan ve yetişkin timus damar 1,2 etiketlemek için kullanılan teknikler tarif var. Biz burada embriyonik timus kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir tekniği göstermek. Yüz damar enjeksiyonu ve CD31 antikor boyama timüs va tespit etmek – bu yöntem simplicifolia lektin I (isolectin B 4 GSL 1) FITC-dekstran ya da Griffonia (Bandeiraea) kullanılması birleştirirscular yapıları ve PDGFR-β timik perivasküler mezenşimi 3-5 etiketlemek için. Cryosections veya vibratome bölümleri kullanma seçeneği de sağlanır. Bu protokol, timüs kan damarı oluşumuna TEC-türetilen molekülleri rollerin tanımlanması için kritik olan timus damar bozuklukları, belirlemek için kullanılabilir. Yöntemi, tüm damar etiket olarak, aynı zamanda deri ve kalp 6-10 içeren embriyo boyunca birden fazla organ ve dokularda damar ağları analiz etmek için de kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Bölümlerde Tüm-mount ve PECAM-1 (CD31) boyama embriyonik farelerde damar etiketleme için geleneksel yöntemler vardır. Bu yöntemler doğrudan ve / veya dolaylı immunfloresan ve deterjan kullanımı fare doku geçirgenliği gerektirir. Bu oldukça zamanında süreç olduğunu kanıtlıyor. Burada, FITC-dekstran ya isolectin B 4 yüz damar enjeksiyonu doğrudan böylece antikor etiketleme adımlar için ihtiyacı ortadan kaldırarak, embriyonik damar etiketlemek için istihdam var. 'Sızdıran' f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe numaraları R01AI055001 ve NIAID gelen UYM ve JLB için SREB Tezi Bursu Ödülü R01AI082127 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| FITC-dextran | Sigma | FD150S-1G |
| Fluorescein labeled GSL 1 – isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 |
| PFA | Fluka | 76240 |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR | 25608-930 |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 |
| rat anti-mouse CD31, | BD Pharmingen | 558736 |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 |
| Benzyl Alcohol | Acros Scientific | 148390010 |
| Benzyl Benzoate | Acros Scientific | 105860010 |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Scientific | 152222 |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F |
| Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| 4mL clear vials | National Scientific | B7800-2 |
References
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
