Una basada en PCR genotipificación método para distinguir entre las variedades de tipo silvestre y ornamental de Imperata cylindrica</em

1. Recolección y Conservación Este método fue desarrollado y probado usando frescas, congeladas, secas y, recientemente, los tejidos de las hojas. Identificar las plantas de cogongrass tengan y / o tejidos JBG con la ayuda de un taxónomo que se especializa en la identificación de especies de hierba. Con sus hojas de color rojo brillante, JBG ornamentales es fácil de distinguir visualmente de tipo silvestre y plantas de cogongrass tengan JBG volver, sin embargo, plantas de cogongrass tengan y volver JBG son casi indistinguibles el uno del otro. Cogongrass y el fenotipo JBG volvió tienen hojas verdes, largas y rizomas considerablemente más grande y más largo y más área foliar que la JBG 12 (Figura 1). Tejido de la hoja fresca proporciona el ADN de calidad más abundante y la más alta y se pueden recoger desde el campo o invernadero crecido I. cylindrica plantas. Si el tejido fresco se va a utilizar, extraer el ADN dentro de las 3 horas de recogida para ayudar a prevenir la degradación. De lo contrario, preparar el tejido para el almacenamiento, keeping el tejido fresco y la luz solar directa. Para almacenar los tejidos para la extracción de ADN en una fecha posterior, el método más óptimo es congelar y almacenar el tejido a -80 ° C inmediatamente. No permita que el tejido congelado se descongele antes de la extracción de ADN. Transferir el tejido congelado en nitrógeno líquido antes de la molienda de la extracción de ADN para prevenir la descongelación. Si un -80 ° C congelador no está disponible, el tejido seco inmediatamente. Para el almacenamiento en seco, colocar el tejido en un sobre de papel y almacenar el sobre en gel de sílice deshidratado u otros desecantes activas a temperatura ambiente. Una pequeña cantidad de sílice mezclado con indicador no indica sílice se asegurará de que la sílice está completamente deshidratada y adecuado para secado tejido de la planta. Utilice por lo menos 10 veces más gel de sílice que el tejido de hojas frescas en peso. Tejido vegetal debe secarse en 24 horas. La calidad y cantidad de ADN se reduce a través de almacenamiento en seco con el tiempo (como en el caso de ejemplar de herbarios). 2. Extracción de ADN Para extraer el ADN de los tejidos vegetales, siga el DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, Cat # 69104 o 69106) las instrucciones del fabricante, con una pequeña modificación. En lugar de utilizar el sugerido menos de 100 mg de tejido fresco o inferior a 20 mg de tejido seco para cada columna, moler mayor que 100 mg, y luego transferir 100 mg de tejido fresco o congelado (o> 20 mg de tejido seco) a los tubos apropiados para la extracción. El ADN nuclear y plastidios se extrae de forma simultánea. Antes de iniciar estos procedimientos, asegúrese de que el etanol se añadió a las reservas de AP3 / E y AW. Moler> 100 mg de tejido foliar fresco o congelado (o> 20 mg de tejido de la hoja seca) a un polvo fino utilizando tres rondas de nitrógeno líquido con la molienda en un mortero y almirez refrigerados. Interrupción insuficiente del material de partida o lisis insuficiente también puede conducir a la disminución de los rendimientos de ADN. Con cuidado, moler el TISSUE y no sobrecargar las columnas con un exceso de tejido. Transferir 100 mg de polvo congelado a partir de tejido fresco o congelado (o 20 mg de polvo de tejido seco) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 400 l de tampón AP1 y 4 l de RNasa A. puede Cada tubo colocado en un estante pequeño en un equilibrar para controlar el peso correcto de tejido por tubo. Muestra de vórtice o vibración (s) para mezclar e incubar durante 10 min a 65 ° C, invirtiendo el tubo (s) de 2-3 veces durante la incubación. Añadir 130 l de tampón de AP2 a cada muestra. Mezclar invirtiendo el tubo (s) varias veces, y se incuba durante 5 min en hielo. Pipetear cada lisado en una columna de centrifugación QIAshredder separada Mini, y colocar cada columna en un tubo de recogida de 2 ml (suministrado con el kit). Se centrifuga la columna (s) por 2 min a 20.000 g (~ 14.000 rpm), y transferir cada fracción de flujo a través de en un tubo nuevo (no suministrado con el kit) sin interrumpir cualquier forma de pellets. Añadir 1,5 volúmenes de tampón AP3 /E, y la mezcla por pipeteado. Transferir 650 l de la mezcla en una columna de centrifugación DNeasy Mini en un tubo de recogida de 2 ml. Se centrifuga la columna (s) de 1 min a 6.000 xg (~ 8.000 rpm), y descartar el filtrado. Repetir este paso con la mezcla restante para cada muestra. Colocar la columna de espín (s) en un nuevo tubo de recogida de 2 ml (s), y añadir 500 l de tampón AW a la parte superior de cada columna. Se centrifuga la columna (s) de 1 min a 6.000 xg (~ 8.000 rpm), y descartar el filtrado. Añade otra l 500 de AW de Estabilización para la parte superior de cada columna. Centrifugar durante 2 minutos a 20.000 xg (~ 14.000 rpm). Este paso se seque la columna, eliminando así cualquier etanol residual contenida en los tampones que pueden inhibir la PCR. Transfiera cada columna de centrifugación a un nuevo tubo de 1,5 ml de muestra de microcentrífuga. Añadir 100 l AE tampón a la parte superior de cada columna para la elución, e incubar la columna (s) durante 5 min a temperatura ambiente. Se centrifuga la columna (s) de 1 min a 6.000 xg (aproximadamente 8.000 rpm) para recoger el ADN. Repetir estos pasos elución un tiempo, eluyendo el ADN en el mismo tubo de microcentrífuga 1,5 ml para dar 200 l de muestra. Guarde las muestras de ADN a -20 ° C hasta su uso. Concentraciones de ADN dependen del tipo de tejido y las condiciones de almacenamiento. Rendimientos óptimos se obtienen cuando eluyendo ADN con un total de 200 l de tampón AE, sin embargo, las concentraciones se puede aumentar si se reducen los volúmenes de elución a tan poco como 50 l. 3. Verificación de la calidad y cantidad de ADN Prueba de la calidad y cantidad de ADN extraído antes de la instalación PCR utilizando un espectrofotómetro o fluorómetro y electroforesis en gel. Esto ayudará a asegurar el éxito de las etapas subsiguientes. El uso de un espectrofotómetro, la calidad y la cantidad de pruebas de ADN. Los buenos rendimientos de ADN debe estar entre 50 y 150 ng / l con 260/280 y 230/280 proporciones cercanas a 2,0. Como un ejemplo, la Figura 2 muestra los resultados de buena calidad usando el espectrofotómetro NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE). Llevar a cabo la electroforesis utilizando un estándar de 1% en gel de agarosa. Verificar la presencia de bandas relativamente grandes (> 10 Kb) sin rayas a poco de la contaminación del ARN (Figura 3). Si la concentración de ADN es alta, el ADN de muestras diluidas a 70 ng / l para los pasos subsiguientes. 4. Los cebadores de PCR La PCR primers utilizados en este protocolo se basa en las diferencias de secuencia entre la región espaciadora plastidio trnL-F de los genotipos Cogongrass y la JBG. Estas diferencias se presentan en forma de SNPs (polimorfismos de nucleótido único) y indeles (inserciones y eliminaciones) que permitieron el desarrollo de determinados variedad-cebadores mediante la localización de los cebadores en los sitios de secuencias únicas (Figura 4). La calidad de los cebadores puede tener un impacto significativo sobre los resultados de la PCR. Orden cebadores de una empresa de renombre. Ordenamos a nuestras cartillas de Oblique Bio, Inc. (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), solicitando únicamente los procedimientos estándar de la desalación. trnL-F cebadores de control positivos: Este conjunto de cebadores amplifica el plástido trnL-F región espaciadora de taxones más hierba 11-13 y sirve como un buen control positivo (que resulta en una banda de 890 pb). Nombre Secuencia TRNF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (5 'del exón)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' De tipo salvaje cebadores Cogongrass: Este primer conjunto es específico para plantas de cogongrass tengan y no amplificar la región trnL-F de la JBG genotipos. Los resultados expuestos en una banda que es 595 pb. Nombre Ssuencia trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' JBG y la JBG Revert cebadores: Este es el juego de primers específicos para JBG genotipo y no amplifica la región trnL-F de plantas de cogongrass tengan. Los resultados expuestos en una banda que es 594 pb. Nombre Secuencia trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' Resuspender cada cebador en un volumen suficiente de libre de nucleasa S ddH 2 para obtener un 100 mM de soluciones de valores que pueden ser almacenadas a -20 ° C, a largo plazo. Diluir cada acción de imprimación y 12 mm antes de los pasos de configuración de la PCR. 5. PCR de configuración Extracciones de ADN se amplificó utilizando cada uno de los conjuntos de cebadores anteriores en las reacciones de PCR. Incluir un control positivo para garantizar que todos los reactivos de PCR están funcionando bien y puede generar una banda. Incluir un control negativo para asegurar que ninguno de los reactivos están contaminados con ADN deseado. El control negativo no contiene-plantilla y debe dar lugar a ninguna producción banda. Preparar todas las reacciones en tubos de paredes finas de la PCR para permitir una mejor transferencia de calor entre el bloque termociclador y la muestra. Se recomienda utilizar disponibles en el mercado de aerosoles libres de puntas de pipeta para ayudar a evitar la contaminación. Para cada muestra de ADN aislado, establecido de 50 l reacciones de PCR utilizando cada uno de los conjuntos de primer sobre en 0,2 ml de pared delgada, tubos de PCR mediante la adición de los siguientes reactivos en la ICE en el orden indicado a continuación. Si las muestras múltiples están siendo preparados, hacer un cóctel que contiene todos los reactivos con la excepciónde la plantilla de ADN para establecer condiciones uniformes entre todas las reacciones. Reactivo PCR Volumen usado Concetration final Libre de nucleasa ddH2O 40,5 l Ventaja 2 10X PCR buffer (Clonetech, CA) 5,0 l 10% (v / v) Ventaja UltraPure PCR Mezcla de dNTP (10 mM cada uno, Clonetech, CA) 1,0 l 0,2 mM Primer 1 (12μM en ddH2O) 1,0 l 0,24 mM Primer 2 (12μM en ddH2O) 1,0 l 0,24 mM Ventaja 2 polimerasa Mix (Clonetech, CA) 0,5 l 1% (v / v) De extracción de ADN(70 ng / reacción, ajustar el volumen ddH 2 O, según sea necesario) 1,0 l 1,4 ng / l Total: 50,0 l Para asegurarse de que todos los reactivos de PCR están funcionando bien, configurar el control positivo utilizando los cebadores de control positivo. Este primer conjunto funciona igualmente bien para plantas de cogongrass tengan, JBG, JBG revertir y otras gramíneas y dará lugar a una banda que es de 890 pb. Configuración del control negativo usando el cebador mismo control establecido como control positivo, utilizando ddH 2 O en lugar de la extracción de ADN. Si todos los reactivos están libres de ADN contamina, esta reacción se traducirá en ninguna banda. Si la concentración de ADN es baja, más ADN se puede añadir a cada reacción, ajustando la cantidad de libre de nucleasa S ddH 2 utilizado para llevar el volumen total de reacción a 50 l. No use más de 5 l de ADN (10% del el volumen total) por reaction, impurezas como posibles contenidos en las muestras de ADN puede inhibir las reacciones de PCR. 6. PCR ciclismo Llevar a cabo amplificaciones de PCR en un termociclador equipado con una tapa térmica con los siguientes parámetros de PCR en bicicleta. Usamos el Mastercycle Pro S termociclador (Eppendorf, Hauppauge, NY) para operar con las condiciones estándar de temperatura rampa. Cualquier termociclador de la calidad debería funcionar bien. Ciclo La desnaturalización de recocido Polimerización 1 2 min a 95 ° C 2 30 segundos a 95 ° C 30 segundos a 61 ° C 90 seg a 68 ° C 35 ciclos 3 5 min a 68 ° C Mantener a 4 ° C hasta que la muestra se retira </td> Optimizar las condiciones para la PCR (incluyendo la temperatura hibridación del cebador, los tiempos de extensión, y el número de ciclos) según sea necesario dependiendo de la calidad del ADN, los cebadores, Taq polimerasa o el tipo de termociclador utilizado. Recomendamos utilizar un termociclador capaz gradiente al determinar el óptimo temperaturas de recocido. Si el termociclador siendo utilizado no tiene una tapa calentada, añadir 1 gota de aceite mineral a la parte superior de cada muestra para evitar la evaporación durante los ciclos de PCR. 7. Electroforesis en gel de los productos de PCR Para visualizar los resultados del análisis, separados los productos de PCR en un 1% en gel de agarosa mediante electroforesis estándar. Combinar 2 l de un tampón de ADN de carga estándar (típicamente una solución 5x o 6x) con 5 l de cada producto de PCR amplificado. Cargar las muestras en un gel de agarosa al 1% que contenga bromuro de etidio (bromuro de etidio para la tinción de ADN) hizo con el correoither TAE o SB (borato de sodio) los sistemas de amortiguación 16. Usamos 1 l de un 10 mg / ml de solución madre de EtBr por 100 ml de agarosa al 1% (0,1 g / ml). Ejecutar las muestras a ~ 120V hasta que el frente de colorante llega a ¾ de la longitud total del gel. Bajo la luz ultravioleta (por ejemplo, un UV de onda corta caja de luz), inspeccionar las bandas resultantes para ver si un fragmento de su caso se amplificó. Documentar el gel y las bandas que resulten disponibles mediante un foto-documentación del sistema o de la cámara. 8. Los resultados representativos Tras la visualización de los productos de PCR, plantas de cogongrass tengan tiene un patrón único de bandas en comparación con la de JBG o revertido JBG (Figura 5). Para cada muestra de ADN, el trnL-F positivo conjunto de cebadores de control debe dar lugar a una sola de alta intensidad de la banda de ~ 890 pb. Esto verifica que todos los reactivos de PCR están funcionando bien. Del mismo modo, el control negativo (sin plantilla) la reacción no debe contener las bandas para cualquier s imprimaciónet utilizado. Esto verifica que ninguno de los reactivos estaban contaminadas. Si la muestra de ADN se deriva de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan, una reacción PCR utilizando el conjunto de cebadores específicos de plantas de cogongrass tengan resultará en una banda única en ~ 595 pb, mientras que los cebadores específicos de JBG resultará en ninguna banda. Asimismo, si la muestra de ADN se deriva de JBG o revertido JBG, una reacción PCR utilizando el conjunto de cebadores JBG-específica se traducirá en una banda única en ~ 594 pb, mientras que los cebadores específicos de plantas de cogongrass tengan resultará en ninguna banda. Como JBG y JBG volvió tienen una secuencia idéntica de ácido nucleico, que por lo tanto, se tienen los mismos patrones de bandas. Si muchas muestras se compararon en un gel al mismo tiempo, se recomienda ejecutar todas las muestras derivadas de cada cebador situado junto a una otra, haciendo así más fácil para escanear las muestras para los resultados positivos. Las diferencias morfológicas entre las JBG y vuelve JBG son bastante obvias (por ejemplo, el color rojo de las hojas y la talla de JB G vs la coloración verde, mayor estatura y el crecimiento agresivo de la JBG volver), así que mientras los resultados de PCR será el mismo, las variedades JBG son fáciles de distinguir con morfología de la planta. Figura 1. Comparación de efecto invernadero crecido Imperata cylindrica var. Koenigii (hierba sangre japonesa), volvió I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) y I. cylindrica (de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan). Figura 2. Un ejemplo de muestras de ADN verificadas utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. Nótese que, con independencia del espectrofotómetro utilizado, la relación 260/280 debe estar cerca de 1,8 y la relación de 260/230 debe cerrar a 2,0. CONTENIDO "> Muestras Figura 3. ADN verificada mediante electroforesis en gel estándar en un 1% en gel de agarosa. Un marcador de ADN comercial se utilizó para el análisis de tamaño. Lane # 4 es un ejemplo de muestra pobre calidad de ADN, que muestra manchas y cierta contaminación del ARN. Alineaciones Figura 4. Secuencia de las regiones F-trnL de Imperata cylindrica var. Koenigii (hierba sangre japonesa), volvió I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) y I. cylindrica (de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan). Verticales flechas negras indican diferencias en las secuencias que resultan de los SNPs y indeles. Horizontal flechas verdes indican las posiciones de los cebadores de tipo salvaje Cogongrass utilizados para plantas de cogongrass tengan PCR específica. Horizontal flechas rojas indican la posiciones de la JBG y la JBG Revert primers utilizados para la JBG-PCR específica. Figura 5. Resultado representativo de electroforesis en gel de los productos de PCR derivados de plantas de cogongrass tengan, JBG y JBG revertir muestras de ADN combinadas con Cogongrass-y JBG cebadores específicos, así como la trnL-F de control positivo y un control sin molde negativo.