1. Подготовка EM сеток для углеродного покрытия Наполните большую стеклянную мензурку с дистиллированной водой. Используйте стеклянную пипетку, чтобы падение одной капли коллодия (~ 20 мкл, 2% в амилацетат, Электрон наук микроскопии, штат Пенсильвания, США) на поверхности воды. Коллодия будет распространяться на форму тонкого пластического слоя на границе раздела вода / воздух поверхность; Примечание: первая капля коллодия могут быть использованы для очистки поверхности воды от любых частиц пыли. После удаления пленки с первыми каплями, водная поверхность свободна от пыли. Место EM сеток, 400 или 200 меш Гилдер Cu сетки приобрести у Теда Пелла Inc (США), по одному на пластиковый слой, плавающих на поверхности воды; Мы обычно место 50 ~ 100 сеток в плотной упаковке узор, с блестящими сторону сетки вниз в пластиковый слой (рис. 1А). Примечание: 400 сетки сетки хороши для обычного отрицательного пятна сетки ЭМ, тогда как 200 сетки сетки хороши для сбора наклона изображения пары. Вырезать пирогсе бумаги с размерами чуть больше, чем область, где сетки размещаются на слой пластика. Положите бумагу тщательно поверх сетки (рис. 1б), и ждать, пока бумага становится полностью мокрой (рис. 1в). Примечание: Различные виды бумаги имеют различные ставки поглощения воды. Важно, чтобы бумага не впитывает воду слишком быстро. Например, регулярное фильтровальная бумага не подходит для этой цели, потому что он впитывает воду слишком быстро, и делает много морщин. Углеродной пленки из краев бумаги не является плоским, и поэтому не подходит для сбора наклона изображения пары случайных конической реконструкции 3D наклона. Нужно проверить различные работы, чтобы найти подходящую. В нашей лаборатории мы используем бумаги из блокнота купил у местного продуктового магазина. Иногда газетной бумаги было также установлено, что подходит. Другим вариантом является использование относительных толстой рисовой бумаги используются для китайских / японская каллиграфия. Быстро сделать разрезы на пластиковой пленки вокруг и рядом спропитанной бумаги. Сразу же после этого, используйте пару щипцов, чтобы забрать бумаги с сетками зажата между пленкой и бумагой. Положите бумагу в чашке Петри с сетками вверх для сушки на воздухе (рис. 1D); Примечание: Очень важно, чтобы бумага воздушно-сухой. Сушка слишком быстро генерирует множество морщин в бумагу. 2. Сетки Carbon покрытий Углеродного покрытия машины, используемые в нашей лаборатории Cressington 208C высокого вакуума Turbo Carbon Coater (Тед Пелла). Наша система оснащена толщина Cressington фильм монитор, который измеряет толщину пленки углерода на основе принципа, что частоты колебаний кристалла кварца изменяется масса осажденной пленки на ее поверхности. Тем не менее, протокол, описанный здесь, не требует толщину монитора, так как она часто не доступны в любой лаборатории. Резкость угольный стержень использованием точилка (Тед Пелла) и стержни нагрузки углерода в углеродных покрытий мachine (рис. 2). Два стержня, один с острым концом, а другой с плоским концом расположены друг против друга. Применение вакуумной смазки на половину площади матовом стекле и поместить его рядом с сетками (рис. 2В). Только половина из замороженного участка в стекле должна быть покрыта вакуумной смазкой. Примечание: район с вакуумной смазки не изменит цвет после углеродного покрытия. Контраст между прилегающих территорий с и без вакуумной смазкой обеспечивает оценку толщины покрытых углеродом. Положите бумагу с сетками на сцене углерода машины покрытием. Место стекло рядом с сетками (рис. 2). Примечание: Можно также первой сетки передачи покрыта пластиковой пленкой, чтобы стекло перед нанесением покрытия, в случае многих сетки отвалиться от бумаги. Насос вакуумной камере, и ждать, пока вакуум не достигнет уровня 10 -5 Торр. Примечание: покрытие с низким вакуумом часто порождает много искр, в результате чего многие крупные частицы углерода насетке. Увеличение текущих очень медленно. Острым наконечником из графитовых стержней сначала становятся красными, а затем белыми, как ток возрастает. Не смотрите высокой яркости наконечник непосредственно с невооруженным глазом. Стоп увеличением тока, когда покрытие начинает. Стекло будет менять цвет от белого до светло-серого, а затем темно-серый. Мрак слайды коррелирует толщина пленки углерода будучи покрытием. Включите текущей прочь к остановке, когда покрытие нужной толщины была достигнута (рис. 2D). Примечание: 1) После повторной углеродного покрытия процессы, покрытые углеродной изнутри колпаком стекло может темнеть его цвет. Это делает покрытие углеродной пленки появляются толще, чем есть на самом деле. 2) Один заостренными угольный стержень может быть использован для нескольких покрытий. Острота кончика постепенно уменьшается после каждого покрытия. Максимальный ток зависит от остроты угольный стержень. Недавно заостренным стержнем с меньшим диаметром требует относительной нижетока испаряется углерод. Позже покрытие может потребоваться несколько выше текущей. Vent вакуумную камеру и удалить покрытие сетки для дальнейшего использования. Примечание 1. Более точный метод управления углерода толщиной с помощью мониторинга толщины пленки. Или можно качественно калибровки цвета с точным толщина измеряется монитора. Полезной толщины углерода для этой техники составляет от 3 до 7 нм. Это простой и легкий способ получения большого количества углерода покрытием сетки, как правило, ~ 100 сетки на подготовку. Сетки содержат тонкий слой пластика, который обычно не влияет на качество негативно окрашенные изображения. Тем не менее, сетки, подготовленный в этот метод не подходит для cryoEM. Этот слой пластика могут быть удалены путем замачивания сетки в хлороформе в течение нескольких часов. 3. Подготовка уранила формиат решение (0,75%) за негативное пятно EM. Подробный протокол былописано выше 5 Отвешивать 37.5mg уранила формиат в небольшой стакан; Добавьте 5 мл кипящей воды и перемешать в течение 5 минут в темноте; Добавить 10 мкл 5М NaOH, продолжать движение в течение 5 минут; Фильтры решения с использованием шприца фильтр (Fisherbrand, 13мм шприц фильтр, 0,2 мкм, нейлон нестерильные, каталожный номер 09-720-5), и хранить отфильтрованный раствор в трубке 8ml Сокол покрыта алюминиевой фольгой; Примечание. Уранила Формиат порошок можно купить в электронной микроскопии наук (Hatfield, PA), номер по каталогу 22451. Решение уранила формиата светочувствительных и следует держать подальше от прямых солнечных лучей, например, покрытие трубки Сокол с алюминиевой фольгой. Свежеприготовленный раствор светло-желтого цвета (рис. 3А). Пятно решение может находиться на скамейке для одной-двух недель до его начала осаждения. Уранила формиата кислые с рН ~ 4. Добавление NaOH увеличивает рН, но и добавить его слишком быстроили в избытке может вызвать пятна на осадок. В дополнение к генерации напротив, уранил формиата также исправляет белка образца. Потому что фиксация скорости происходит настолько быстро, низкий рН обычно не влияют на общую конформации белка или белкового комплекса, образование 7. 4. Протокол для подготовки отрицательного пятна EM сетки. Этот протокол был подробно описан ранее 5 Тлеющего разряда углерода покрытые сеткой, используя PELCO easiGlow GlowDischarge системы (Ted Пелла, США). Тока, используемого в 15 мА и сетки свечение выписан в течение 30 сек. Примечание. Раскаленной выписан сетки должны быть использованы сразу после свечения разряда. Мы часто используем сетки менее чем через 2 часа после тлеющего разряда. Поместите два 20 мкл капель дистиллированной воды и 25 мкл две капли уранила решение формиата на кусочек парафильмом (рис. 3В). Держите тлеющего выписан сетки с использованием обратной силы анти-капиллярной щипцы с автомобилембон-покрытием вверх. Примечание: Следует использовать анти-капиллярной щипцами. В противном случае, жидкого образца будет отсасывается из сетки от капиллярных сил между щипцами. Применить 2μl образец белка тлеющего выписан сетке, и ждать 30 сек. Примечание: время ожидания и длины тлеющего разряда влияние концентрации белков, адсорбированных в сетку. Очень разбавленные образцы требуют более адсорбции раз. Однако длительное адсорбции может изменить буфер так как концентрация водяных паров. Чтобы добиться правильного распределения частиц в сетке требует несколько проб и ошибок. Пятно от примера с использованием фильтровальной бумаги. Сенсорный сетки поверхности капли воды, а затем пятно от воды фильтровальной бумагой. Повторите второй капли воды. Сенсорный сетки поверхности, чтобы первая капля пятно кратко. Пятно от окраски раствора с фильтровальной бумаги. Сенсорный сетки поверхности на вторую каплю пятно в течение 20 секунд. Пятно оFF пятно решение фильтровальной бумагой. Сухой сетку, используя вакуум. Примечание: можно также оставить сетки на скамейке или в химической капотом высохнуть на воздухе. Преимущество вакуумных сухих является то, что можно наблюдать сеток в EM немедленно. Возможно артефакт порожденных быстрое высыхание неравномерно пятно. 5. Просвечивающей электронной микроскопии Микроскоп используется в этой демонстрации является Tecnai T12 (FEI Company) оснащен Gatan 4K 4K х камер CCD. Кратко проверить выравнивание микроскоп, прежде чем вставлять образца; Примечание: Это необходимо только один раз в EM сессии. В модели микроскопа, около идеального выравнивания могут быть сохранены ранее. Загрузка таких выравнивание файла должны восстановить микроскопом выравнивания около идеальном состоянии. Нагрузка сетки ЭМ в одном наклона стандартный держатель образца. Вставьте держатель в CompuStage из T12. Подождите цикла перекачки, чтобы закончить. Вставьте держатель в столбце. </ LI> Фокус образца и установить желаемый расфокусировки, как правило, 1.5um. Примечание: Фокусировка может быть достигнуто либо путем ручной фокусировки с использованием минимального метод контраста или с помощью ПЗС-камеры для съемки изображения в реальном времени и вычислительных жить мощности спектра Фурье. Запись изображения с помощью ПЗС-камеры; В образах негативно окрашенных образцов белков, белки часто видели с белый контраст, то есть белая плотностью от темного фона. Обратите внимание, что в то время как концентрации белка в различных областях же сетки, как правило, очень похожи, человек не наблюдать различные уровни пятна в разных районах одного и того же сетки. Иногда местах может иметь неравномерное окрашивание или даже положительное окрашивание (белок кажется темным на светлом фоне), тогда как в некоторых других районах в совершенстве пятно. Очень часто приходится искать сетку, чтобы найти хорошее место для съемки. 6. Представитель Результаты Примеры типичных хорошие изображения отрицательно станцииINED образцов, лошади селезенка ферритина (рис. 4А), Fab (рис. 4б), архейных 20S протеасом (рис. 4в) и нуклеосом (рис. 4) показаны. Рисунок 1. Подготовка углерода покрытием сетки для отрицательных пятно EM.) Размещение EM сетки одна за другой в закрытой упаковке узор на поверхности коллодия фильма. Б) Размещение лист бумаги чуть больше, чем площадь сетки. C) Подождите, пока бумага становится совершенно мокрая. D) Возьмите этот документ вместе с сетками для воздушной сушки. Рисунок 2. . Покрытие EM сетки с углеродом) установки углерода испарителя: место двух стержней углерода в покрытии аппарата, с одной удочкой (слева) обострены до точки чаевые. Другой стержень (справа) имеет плоскую поверхность и вступают в контакт с точкой кончика один в противоположную ыязь. Б) Место небольшим количеством вакуумной смазки в одну сторону способствовали стекло. Область в черной рамке имеет вакуумной смазкой. C) установки сетки для покрытия. Предметные стекла используются для хранения бумаги в положение. Стрелки точках области с вакуумной смазкой. D) После нанесения покрытия, цвет слайд с вакуумной смазки покрыты не меняет цвет. Контраст указывает толщину покрытием углерода. Рисунок 3. Иллюстрируя отрицательные процедуры окрашивания.) Свежеприготовленный (слева) уранила формиат раствор прозрачный без знака осадков. Через 1 ~ 2 недели, осадки начинают накапливаться в дно в нижней части трубы. Б) Место две капли (~ 25 мкл) дистиллированной воды и две капли уранила формиат решение в части парафильмом. Используйте пару анти-капиллярной щипцы провести свечение разряжен, покрытую углеродом, Е. М. сетку с углеродом стороневверх. Капли образца (~ 2μl) помещают в сетку. C) После ожидания в течение 30 секунд, промокните решение с фильтровальной бумаги. D) Флип сетки на ощупь образец сторону сетки с первой капли воды. Повторите шаг C и D для завершения процесса окрашивания. Рисунок 4. Примеры EM образы негативно окрашенных образцов белка.) Верховая селезенки ферритина, Б) фрагмент связывания антигена (Fab), С) архейных 20S протеасомы и D) нуклеосом. Все изображения были записаны с тем же увеличением. Шкалы является 20 нм.