M celler i et spesialisert follicle-assosiert epitel dekker Peyer er patcher spiller en viktig rolle for mucosal immunosurveillance i gut-assosiert lymfoid vev. Her har vi beskrev evalueringsmetode for bakteriell transcytosis av M celler<em> In vivo</em>. Denne metoden gir en metode for å forstå M-celle funksjon i immunsystemet.
Innsiden av tarmen vår er bebodd med enorme antall commensal bakterier. Mucosal overflaten av gastrointestinaltraktus er kontinuerlig utsatt for dem og noen ganger til patogener. Tarmen-assosiert lymfoid vev (Galt) spiller en nøkkelrolle for induksjon av mucosal immunresponsen på disse mikrobene 1, 2. For å starte mucosal immunrespons, må mucosal antigener skal transporteres fra tarmen lumen over epiteliale barriere i organiserte lymfoide follikler som Peyer er patcher. Dette antigen transcytosis er mediert av spesialiserte epitelceller M celler 3, 4. M celler er atypiske epiteliale celler som aktivt phagocytose makromolekyler og mikrober. I motsetning til dendrittiske celler (DCS) og makrofager som mål antigener til lysosomer for nedbrytning, M celler hovedsakelig transcytose den internaliserte antigener. Dette livskraftige macromolecular transcytosis gjennom M celler leverer antigen til den underliggende organiserte lymfoide follikler end antas å være avgjørende for å initiere antigen-spesifikke slimhinnene immunrespons. Men de molekylære mekanismene som fremmer dette antigen opptak av M celler er i stor grad ukjent. Vi har tidligere rapportert at glykoprotein 2 (GP2), spesifikt uttrykt på den apikale plasma membran av M celler blant enterocytter, fungerer som et transcytotic reseptor for en undergruppe av commensal og patogene enterobacteria, inkludert Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium ), ved å anerkjenne FimH, en komponent av type I pili på bakteriens ytre membran 5. Her presenterer vi en metode for anvendelse av en mus Peyer er patch intestinal sløyfe analysen å vurdere bakteriell opptak av M celler. Denne metoden er en forbedret versjon av musa intestinal sløyfe analysen tidligere beskrevet 6, 7. Den forbedrede punktene er som følger: 1. Isofluran ble brukt som anestesimiddel. 2. Ca 1 cm ligated intestinal sløyfe inkluing Peyer sin patch ble satt opp. 3. Bakterier tatt opp av M celler ble fluorescensmerkede av fluorescens merking reagens eller ved overekspresjon fluorescerende protein som grønn fluorescerende protein (GFP). Fire. M cellene i hårsekken-assosiert epitel dekker Peyer sin lapp ble oppdaget av hel-mount immunostainig med anti GP2 antistoff. 5. Fluorescent bakteriell transcytosis av M celler ble observert av confocal mikroskopisk analyse. Musen Peyer er patch intestinal sløyfe analysen kunne levere svaret hva slags commensal eller sykdomsfremkallende bakterier transcytosed av M celler, og kan lede oss til å forstå den molekylære mekanismen for hvordan å stimulere slimhinnene immunforsvaret gjennom M celler.
Inkubasjonstiden for ligated Peyer sin lapp med bakteriell suspensjon er vanligvis for 1 time å observere den bakterielle innlemmelse i M celler. Ved 4 timer inkubering, er bakteriene ofte påvist i T-celle sonen Peyer sin patcher. Som fordampede isofluran inhalant anestesi kunne holde mus stabil, er det inkubasjonstid på ligated Peyer sin lapp med bakteriell suspensjon utvides til å observere bakterier som flytter inn i T-celle-sonen i Peyer sin patch. Det viktige poenget med dette eksperimentet er å ta forsi…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke alle EIB medlemmer for å utvikle denne teknikken. Denne forskningen ble støttet delvis av Grant-i-Aid for vitenskapelig forskning på prioriterte områder "Membrane Traffic" (HO), og "Matrix of Infectious Phenomena" (KH), Unge Forskere (SF og KH) og Scientific Research (HO ), og forskning på innovative områder "Intracellulær Logistics" (HO) fra Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
LB Agar Ampicillin- 100 |
SIGMA | L5667 | |
Cy3 mono-Reactive Dye Pack |
GE Healthcare | PA23001 | |
Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester |
Invitrogen | A10168 | |
Inhalation anesthesia apparatus |
Shinano Seisakusho | SN-487 | |
Fixation and Permeabilization Solution |
BD | 554722 | |
Anti mouse Glycoprotein 2 antibody |
MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
Goat Anti-Rat IgG, F(ab’)2 fragment specific |
Jackson ImmunoResearch |
112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
Alexa Fluor 633 Phalloidin |
Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
Confocal laser scanning microscope |
Leica Microsystems | DMIRE2 | |
DeltaVision Restoration deconvolution microscope |
Applied Precision | DeltaVision Core |