Imágenes de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en la presión intraluminal de alta

1. Aislamiento de las arterias carótidas Euthanase10 semanas de edad ratas Sprague Dawley a través de CO 2 / O 2 asfixia. Los impuestos especiales a la izquierda y la derecha arterias carótidas comunes con la aorta y el corazón de garantizar un mínimo de estiramiento de los vasos. En el hielo frío buffer Krebs separar las arterias carótidas de la aorta y el corazón y llevar a cabo la disección de cerca. Mantener los vasos aislados en Krebs en el hielo antes de su montaje. Aprox. tiempo = 45 minutos 2. Cebado de la cámara de buques En los conectores proximales y distales de la cámara de recipiente tampón Krebs ras mantiene a un pH fisiológico mediante la infusión de gas carbogen (95% O 2, 5% CO 2) a través del buffer a 37 ° C. Asegúrese de que los tubos y cánulas se vacían por completo y están alineados. Ras buffer Krebs a través de la P1 (proximal) y transductores P2 (distal). Cerrar los grifos para asegurar que no burbujas de aire en los transductores. Conecte los transductores a los conectores correspondientes y una vez más al ras más tampón de Krebs asegurando que no haya burbujas de aire. Cerrar los grifos de la cámara. Aprox. tiempo = 15 minutos 3. Presurización de la cámara de buques A su vez sobre equipos a presión: la presión servo, control de la presión, la bomba peristáltica (Figura 1). Con la bomba peristáltica en la presión y el motor de la presión en automático ejecutar buffer Krebs a través del tubo de 20 mm Hg (dial a 1), asegurando que no haya burbujas de aire. Conecte el tubo del transductor P2 cerrado. La presión será estable. Abra el grifo P2 a la cámara de recipiente para eliminar cualquier burbuja de entonces se cierra. Llene la bañera con buffer Krebs (5-7 ml). Aprox. tiempo = 10 minutos 4. Montaje de la embarcación Bajo un microscopio de disección lazos lugar poliéster de color negro en cada cánula (Figura 2). Mueva las cánulas y los titulares de la cánula aparte y montar vaso ¼ (aórtica final del arco) en la cánula P1. Asegúrese de no romper el barco. Utilizando una jeringa llena de Krebs buffer lave cuidadosamente el exceso de sangre fuera de los vasos a través de transductor P1. Cerca de P1 a la cámara. Recipiente seguro a la cánula P1 con la corbata de poliéster. Mueva cánulas / los titulares de la cánula más para el montaje en la cánula P2. Montaje final distal del vaso (~ ¼ de la longitud) en la cánula distal. Seguro con corbata de poliéster. Aprox. tiempo = 20 minutos 5. Presurización de la nave Ajustar los titulares de la cánula para asegurar que no doblarse o estirarse en el vaso. Con P1 y P2 cerrada a la cámara de cambiar el servo de la presión de automático a manual. Compruebe la presión en el servo no hay una disminución continua de la presión dentro de los 10 segundos. Si hay una fuga que está ocurriendo y las conexiones y los transductores deben ser garantizados en su lugar. Ajustar el servo de presión de nuevo a P2 automática a continuación, abra la cámara. Bajo el microscopio observe el buque se dilatan cuando el grifo está abierto a la cámara. Cambiar el servo a la presión manual. Una vez más compruebe continua disminución de la presión dentro de los 10 segundos. Si hay una fuga, entonces el sistema no es a prueba de presión y no es probable que sea un agujero en el barco. Volver a abrir P1 automático de la cámara. En la configuración manual de comprobar que la presión se mantiene estable. Si no hay fuga, en el dial de ajuste manual de aumentar a 2 (40 mmHg). Ajuste automático de la nave y observar bajo el microscopio. Si es necesario, ajustar el titular de la cánula para asegurar que no se doble en el que no haya fugas vessel.Check sobre la configuración manual. Repita los pasos 5,6 a 5,7 el aumento de la línea de 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) y así sucesivamente hasta que la presión deseada. Aprox. tiempo = 15 – 30 minutos 6. La incubación de la embarcación a presión Conecte el conjunto de control de temperatura a 37 ° C. Con una segunda bomba peristáltica perfusión Krebs buffer (1 ml / min) en el baño de la cámara de los buques. Conecte la cámara de aspiración para asegurar que sólo la capa superior de la bañera se ha eliminado. Incubar recipiente presurizado a 37 ° C durante 1 hora con la presión establecida en automático. Compruebe la presión no tiene fugas (el cambio a manual) de forma periódica. Los efectos de diversas intervenciones farmacológicas se puede observar mediante la simple adición del compuesto al baño durante la incubación. Aprox. = tiempo de 1 hora 7. Perfusión del recipiente a presión con sangre entera Durante la incubación obtener al menos 7,5 ml de sangre humana / buque recogidos en 40 U de heparina / ml de sangre. Incubar en un falcon de 50 ml a 37 ° C. 10 minutos antes del final de tque la sangre de incubación etiqueta con VybrantDil (1:1000) durante 10 minutos a 37 ° C en la oscuridad. Después de 10 minutos, recoger la sangre en una jeringa claro que las burbujas y colocar en una bomba de jeringa con una chaqueta de calor a 37 ° C. Cierre transductor P1 a la cámara / buque y conectar la jeringa y tubo de drenaje. Purga de sangre a 1000 l / min a través del tubo de drenaje para eliminar las burbujas. Abrir P1 a la cámara. El servo de presión se ajustará automáticamente para mantener la presión deseada. Perfusión de sangre a 100 l / min. Utilizando un microscopio de fluorescencia acoplado a una cámara digital de registro de dos campos de la embarcación perfusión durante 15 segundos a 1, 3, 5, 7,5 y 10 minutos. Integridad después de la perfusión y la función endotelial se puede evaluar a través de técnicas farmacológicas, como miografía y la expresión de moléculas de adhesión se puede determinar mediante técnicas de inmunohistoquímica para validar aún más la respuesta inflamatoria. Aprox. tiempo = 15 minutos 8. Los resultados representativos: Un diagrama esquemático de la configuración de la cámara de presión se muestra en la Figura 1. Con una cámara digital acoplada a un microscopio de fluorescencia resultados se pueden visualizar al instante a través de grabaciones de video en vivo. Representante imágenes de vídeo se ven en la figura 3, donde los leucocitos se consideran para ser adherente al endotelio si se mantuvo estacionario durante 10 segundos. Con grabaciones de vídeo en bucle continuo células adheridas se puede contar como un campo de media por habitante. Mientras tanto baja (Figura 3) y alto (Figura 3 B) presión provocará una cierta cantidad de adhesión de un aumento significativo en la adhesión de leucocitos a la mayor presión intraluminal se ve y esto también se demuestra cuantitativamente (Figura 4). Figura 1. Vivo a presión ex buque de la cámara de esquema. Un buque cánula conectada a una proximal (P1) y un transductor distal (P2) que permite a los transductores de presión de la sangre para ser manipulados dentro del recipiente. La perfusión es a través del transductor de presión P1 y se mantiene a través del transductor P2. Figura 2. Cannuala con lazos. Negro corbatas de poliéster están conectados unos con cánula. Figura 3. Representante imágenes de vídeo. Adhesión celular dinámico (flecha roja) en fluorescencia a 80 mmHg (A) y mmHg 120 (B) después de 10 minutos de la perfusión. Figura 4. Adhesión leucocitaria en las arterias carótidas Sprague Dawley después de 1 hora de incubación a baja (80 mmHg) y alta presión (120 mmHg). *** P <0,001, según el análisis de medidas repetidas de 2 vías ANOVA utilizando el test post hoc de Bonferroni.