하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착
Summary
이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 – 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.
Abstract
전세계, 고혈압은 인구의 약 분기로보고하고 사망률 전세계를위한 최고의 바이오 메디컬 위험 요소입니다. vasculature 고혈압에 내피 기능 장애와 죽상 경화증과 같은 만성 신장 질환 2, 뇌졸중 3 심장 마비 4와 같은 다양한 질병 상태에 선도적인 증가 염증과 관련된 것입니다. atherogenesis로 이어지는 혈관 염증의 초기 단계는 내피를 통해 압연, tethering, 준수 및 leukocytes의 후속 윤회과 관련된 유착 폭포입니다. 내피에 leukocytes의 채용과 축적 그러한에서 혈관 세포 접착 분자 – 1 (VCAM – 1), 세포 세포 접착은 분자 – 1 (ICAM – 1)과 E – selectin뿐만 아니라 증가로 접착 분자의 upregulation에 의해 중재됩니다 시토킨 및 케모카인 릴리스와 반응 산소 종의 upregulation 5. 같은 정적 유착 assays으로 체외 방식의 휴대 전화 부착에 관련된 메커니즘뿐만 아니라 세포 유착 분자의 분석을 결정하는 데 도움이됩니다. 체외 연구에서 이전에 사용된 방법은 내피에 압력 급성 증가는 단핵구 유착, 6 단, 체외의 assays 많은 마찬가지로, 이러한 결과가 실시간으로 수행되지 않은 접착 분자와 염증 마커의 upregulation로 이어질 수있다는 증명 생리적 흐름 조건 하에서 않으며, 전체 혈액과 함께. 따라서, 생체내의 assays에 점점 혈관 염증 및 플라크 개발을 증명하기 위해 동물 모델로 활용하고 있습니다. Intravital 현미경 지금은 널리 백혈구 유착, 압연, 마이 그 레이션과 윤회 7-9을 평가하는 데 사용됩니다. 생체내 연구에 내피 부착하는 백혈구에 대한 압력의 효과를 결합하면 광범위한 것은 덜 수 있습니다. 한 이러한 연구는 immunohistochemistry 10을 통해 평가되었다 동맥 성장과 리모델링하지만 염증성 마커에 대한 흐름과 전단의 실시간 효과를 검사합니다. 여기 우리는 전체 혈액 관류를 사용하여 가압 그대로 혈관에 실시간으로 백혈구 유착을 기록에 대한 모델을 제시한다. 방법론은 그대로 혈관에서 백혈구 – 내피 접착 상호 작용의 실시간 분석을 가능하게 전직 생체내 선박 챔버 재관류 모델 9 수정입니다. 우리 수정 intraluminal 압력뿐만 아니라 생리 흐름 조건뿐만 아니라 압력 조건 하에서 연구에 대한 허용 최대 200 mmHg의 조작이 가능합니다. 압력 myography 시스템은 이전에 혈관 벽 및 루멘 직경 11뿐만 아니라 혈관 수축을 관찰하기 위해 입증되었습니다 동안이 실시간으로 백혈구 – 내피 상호 작용을 보여주는 이번이 처음이다. 여기 쥐가에서 수확하고 형광 현미경을 결합 맞춤 제작 흐름 실로 cannulated 경동맥 동맥을 사용하는 방법을 보여줍니다. 선박 챔버는 이미지를 배가하기 위해 짧은 작동 거리와 큰 직경의 객관적인 렌즈를 허용하는 큰 바닥 coverglass 갖추고 있습니다. 또한, 선택한 작용제 및 / 또는 antagonists가 추가로 세포 접착을 조절하는 메커니즘을 조사하기 위해 이용하실 수 있습니다. intravital 현미경을 통해이 방법의 장점은 침략적 수술에 대한 개입을 포함하지 않으며 따라서 더 높은 처리량을 얻을 수 있습니다. intravital은 체계 억제제 치료를 가능하게하는 반면이 방법은 원하는 그릇에 현지 억제제 치료의 사용을 수 있습니다.
Protocol
Discussion
이것은 실시간으로 가압 조건 하에서 그대로 고립 혈관의 내피에 백혈구 유착을 공부하는 수정 방법입니다. 혼자 선박 챔버의 재관류 대형 쥐 및 쥐 선박의 프로 염증성 계통의 빠른 확인이 가능합니다. 사용 압력 조작은 동적 세포 상호 작용을함으로써 더 나은 모방 – 대답은 매우 높은 생리 intraluminal 압력, 그리고 pathophysiological 조건에 낮은에서 관찰 수 있습니다. 혈관의 직경도 충분한 셀 이미징 프로그램을 사용하고 있으므로 전단 흐름과 속도가 결정되므로 조절할 수 측정할 수 있습니다.
그 myograph 기능, 욕실에 배치 약리 중재는이 모델이 기계론의와 신호 경로의 연구를 활성화 가능 실험 조건에 또 다른 차원을 추가합니다. 내피 보존이 압력 조작하는 동안 확인되지 않을 수 있지만, ACH 및 PE에 대한 답변이 게시물 재관류 9 실시하실 수 있습니다.
이것이 설치가 휴대 전화의 상호 작용하지 타악기 혈액의 흐름이나 수축기 또는 diastolic 압력의 영향에 intraluminal 압력의 효과를 보여주는 것을인지해야합니다. 백혈구 유착에 대한 급성 압력의 변화가 관찰 동안 또한,이 설정은 또한 만성 압력 효과 (즉, 배양 시간을 증가하고 만성 압력 동물 모델을 사용)를보고 활용하실 수 있습니다. 스프 라그 돌리 일반적인 경동맥 동맥이 설정에서 보여주지만 다른 변종과 종의은 정맥의 크기에 적절한 조정과 함께 사용할 수 있습니다. 실제로, 동물의 연령 및 체중은 설정가 각 선박에 대한 개별 수 있어야함을 따라서 선박의 크기에 영향을하고 있습니다하는 것이 중요합니다. 결합 조직의 닫고주의 절개는 대단히 leukocytes의 시각화를 향상시킬 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 빅토리아 정부의 OIS 프로그램, 국민 건강과 호주 프로그램과 프로젝트 보조금의 의학 연구 협의회 (JPF 친 – 더스팅) 및 대학원 장학금 (D 미셸)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Microscope | Carl Zeiss, Inc | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS – 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM – 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT – F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 .
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
