فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية
Summary
التحلل الضوئي للمركبات في قفص يسمح للإنتاج زيادات سريعة ومحلية في مختلف تركيز المركبات النشطة من الناحية الفسيولوجية. هنا ، وتبين لنا كيفية الحصول على التصحيح ، المشبك التسجيلات جنبا إلى جنب مع التحليل الضوئي في مخيم في قفص أو قفص كاليفورنيا لدراسة تنبيغ الشمية في الخلايا العصبية الشمية فصل الماوس الحسية.
Abstract
التحلل الضوئي للمركبات في قفص يسمح للإنتاج زيادات سريعة ومحلية في مختلف تركيز المركبات النشطة فسيولوجيا 1. المركبات التي هي عبارة عن جزيئات في قفص خاملة من الناحية الفسيولوجية عن طريق قفص الكيميائية التي يمكن كسرها ومضة من الضوء فوق البنفسجي. هنا ، وتبين لنا كيفية الحصول على التصحيح ، جنبا إلى جنب مع تسجيلات المشبك التحلل الضوئي للمركبات في قفص لدراسة تنبيغ الشمية في الخلايا العصبية الشمية فصل الماوس الحسية. عملية تنبيغ الشم (الشكل 1) يحدث في الخلايا العصبية الحسية الأهداب الشمية ، حيث ملزم لمستقبلات الرائحة يؤدي إلى زيادة في مخيم الذي يفتح بوابات دوري النوكليوتيدات (CNG) قنوات 2. كاليفورنيا الدخول من خلال القنوات CNG تنشيط قنوات الكالسيوم تنشيط الكلورين. نعرض كيفية فصل الخلايا العصبية من الماوس ظهارة شمية (3) وكيفية تفعيل قنوات الغاز الطبيعي المضغوط أو تنشيط قنوات الكالسيوم الكلور بواسطة التحلل الضوئي في مخيم قفص 4 أو 5 في قفص كا </ سوب>. نستخدم مصباح فلاش 6،7 لتطبيق ومضات الأشعة فوق البنفسجية إلى المنطقة الهدبية إلى مخيم uncage أو الكالسيوم في حين تؤخذ التصحيح ، المشبك تسجيلات لقياس التيار في تكوين الجهد المشبك خلية كاملة 11/08.
Protocol
Discussion
فلاش التحلل الضوئي للمركبات في قفص جنبا إلى جنب مع التصحيح ، المشبك التسجيلات هي تقنية مفيدة للحصول على القفزات السريعة والمحلية في تركيز الجزيئات النشطة من الناحية الفسيولوجية داخل وخارج الخلايا. وتم تصنيع عدة أنواع من compounds1 في قفص ، ويمكن تطبيق هذه التقنية لمختلف …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom made | ||
| Filter cube | Olympus | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML |
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8806 |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| Cysteine | Sigma | C9768 |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma | C7275 |
| CsCl | Sigma | C4036 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| DNAse I | Sigma | D4527 |
| EDTA | Sigma | E9884 |
| EGTA | Sigma | E4378 |
| Glucose | Sigma | G5767 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| KOH | Sigma | P1767 |
| Leupeptin | Sigma | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papain | Sigma | P3125 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P1274 |
| NaCl | Sigma | S9888 |
| NaOH | Sigma | S5881 |
| NaPyruvate | Sigma | P2256 |
References
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M., Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. , (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
