Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu
Summary
İşte biz bütün fare karaciğer doku sindirim, hücre zenginleştirme ve flow sitometri izolasyonu gerektiren bir süreçten CD133 eksprese karaciğer kök hücre ve kanser kök hücrelerin izolasyonu tarif. Biz gelişmiş tek hücre izolasyonu ve klonal genişleme için yöntemler içerir.
Abstract
Karaciğer kök hücre ya da oval hücreler, kronik karaciğer hasarı sırasında çoğalırlar ve hepatosit ve cholangiocytes hem içine ayırt önerilmiştir. Buna ek olarak, karaciğer kök hücreleri karaciğer kanseri, Hepatosellüler karsinoma bir altkümesi için öncüleri olarak öne sürülmüştür. Karaciğer gibi herhangi bir solid organ hücre çalışmaları kök başlıca güçlüklerden biri, ayrıntılı analizi için hücre nadir nüfus izolasyon. Örneğin, karaciğer hücrelerinin büyük çoğunluğu non-parankimal hücreler önemli ölçüde daha büyük olan hepatositler (parankimal fraksiyon), vardır. Karaciğer spesifik hücresel bölmeleri (yani parankimal ve non-parankimal kesirler) zenginleştirmek, ve CD45 negatif hücreler için seçerek, biz izin bu raporda proceduresdetailed 600-fold.The üzerinde kök hücrelerin başlangıç popülasyonu zenginleştirmek mümkün bir katı organ hücrelerin nispeten nadir bir nüfus verimli bir şekilde sıralanması. Bu işlem, isolateli etmek için kullanılabilirartmış karaciğer kök hücre proliferasyonu göstermek, normal fare karaciğer ver kök hücrelerin yanı sıra kronik karaciğer hasarı modelleri. Canlı hücreleri kullanarak fonksiyonel çalışmalar ilk co-lokalizasyon deneyler sonrasında yapılabilir gibi bu yöntem, dondurulmuş veya formalin tespitli karaciğer standart immunohistokimyasal üzerinde açık avantajları vardır. FACS izolasyon detayları özel enstrümantasyon ve temel akım sitometri prosedürlerin güçlü bir çalışma bilgi bağımlı olarak bu raporda özetlenen yordamı gerçekleştirmek için, bir araştırmaya dayalı bir akım sitometri çekirdeği ile bir çalışma ilişkisi kuvvetle teşvik edilir. Bu sürecin belirli bir hedefe klonal in vitro açılabilir karaciğer kök hücrelerinin bir nüfus izole etmektir.
Protocol
Discussion
Hematopoietik sistem aksine, hangi hematopoetik kök hücre replacesnormal fizyolojik turn-üzerinde lökositler, kırmızı kan hücreleri ve trombositler, karaciğer kök hücre, veya yetişkin karaciğer progenitör hücrelerin, normal karaciğer katılmayan bir hücresel farklılaşma sistemi korumak için sorumludur homeostasis. 5,6 akut karaciğer hasarı veya kısmi hepatektomi, hepatositler, sonra farklılaşmış karaciğer epitel olarak, kayıp karaciğer kitlesi yerine yayılması birkaç tur geçmesi. 5,6 Sadece kronik zedelenme sırasında gözlenen karaciğer kök hücreler çoğalmaya. 1,5 -11 Bunlar yetişkin, organ spesifik kök hücreler 1,5-8 İlginçtir, karaciğer kanseri büyük çoğunluğu kronik yaralanma arka plan üzerinde gelişir. hepatosit ve cholangiocytes hem içine ayırt etmek için önerilmiştir ve bu nedenle karaciğer kök hücreleri de olduğu öne sürülmüştür karaciğer kanseri bir altkümesi için öncüleri. 2-4,12-17
Okaraciğer hücre çalışmaları kök önemli sorunlardan ne fonksiyonel analizi için hücrelerin nadir populasyon izolasyonu olduğunu. Örneğin, karaciğer hücrelerinin büyük çoğunluğu cholangiocytes ve diğer küçük olmayan parankimal hücreler önemli ölçüde daha büyük olan hepatositler, vardır. Hücrenin bölmelere (- parankimal fraksiyon ve küçük hücreler – büyük hepatositlerin olmayan parankim fraksiyonu) içine bütün karaciğer kırarak, ve daha fazla CD45 negatif hücrelerin (non-hematopoetik hücreler) için seçerek, biz kök hücrelerin başlangıç popülasyonu zenginleştirmek mümkün 600 kat fazla. Unutmayın ki 1,18-21, biz CD133 + nüfusunun% 100 saf kök hücre popülasyonu, ama açıkça farklı soy ve repopulation potansiyeli ile, hücrelerin heterojen nüfus temsil ettiğini belirten hiçbir şekilde vardır. Alanın önemli sınırlamalar biri kök hücre ve progenitör hücrelerin tanımlarını olduğunu. Biz bu çalışmada daha geniş terim "kök hücre" kullanabilirsiniz, ancak sıkı tanımı, CD133 + non-parenchymal hücreler iki soy progenitör nüfusu temsil eder. Karaciğerde mevcut kök ve progenitör araştırma durumu göz önüne alındığında, bu rapor bu alanda ilgilenen araştırmacılar için bir başlangıç noktası sağlamaz. Bu tür yeni belirteçler EpCAM, 22,23 ya da bu gibi SOX9 gibi transkripsiyon faktörleri, 24 gibi, çıktıkça bunlar dahil edilebilir. Örneğin, biz EpCAM + hücreleri ve CD133 + hücreler arasındaki örtüşme oldukça yüksek oranda bulduk.
Karaciğer kök hücre çoğalması artışı gösteren normal bir fare karaciğer gibi kronik karaciğer hasarı modellerinden kök hücre izolasyonu için bu yazıda ayrıntılı bir süreç. Canlı hücreleri kullanarak fonksiyonel çalışmalar izolasyonu sonra yapılabilir gibi bu yöntem, dondurulmuş veya formalin tespitli karaciğer standart immunohistokimyasal üzerinde belirgin avantajları vardır. 1,3,4 Bu sürecin belirli bir amaç olabilir karaciğer kök hücrelerin nispeten saf nüfusu izole etmektir klonal vitro yaygınlaştırılmalıdır.
<p class = "jove_content"> Bu prosedüre birincil sınırlama izole hücrelerin çoğunluğu (Sorun Giderme bölümüne bakınız) akım sitometri sonra geçerli olmayacak olmasıdır. Bu hücrelerini hazırlamak için gereken saat sonucudur ve önceki izolasyon için nüfus arıtmak için gerekli olan çok sayıda prosedürleri. Karaciğer acil FACS analizi için tek bir hücre süspansiyonu sindirilir ise, hepatosit ve diğer non-parankimal hücreler arasındaki boyut farkı etkili FACS kapısı yaratılması imkansız hale getirecek. Karaciğer dışı parankimal hücrelerin hematopoetik hücrelerin ortadan kaldırmadan, kullanılan varsa, CD133 + hücreler önemli sayıda kesir kirletebilir hematopoetik kökenli olabileceği riski vardır. Ayrıca, Miltenyi filtre yoluyla hücreler işleme göre, tek tek hücreler ve hücre kümeleri oldukça küçük toplanır. Bu örnek FACS alımı iğne tıkamaz sağlar.Bu prosedür için Alternatifler m dahilgibi belirteçler, herhangi bir alternatif hücre yüzeyi gibi CD49f, EpCAM olarak işaretleyici, ya da kombinasyon için odification CD133 + EpCAM + ikinci bir yayınlanan raporda olmayan bir parankimal fraksiyondan karaciğer kök hücreleri izole etmek için bir yoğunluk gradiyenti kullanır. Bu prosedür Ultra-santrifüj (8000 xg) gerektirir, prosedürü için önemli bir zaman ekler ve bizim deneyim, büyük ölçüde ön FACS hücresel verimi ve post-FACS canlılığı azalır. 8
Gelecekteki deneyler fetal böyle HNF3, HNF4α gibi karaciğer genlerin ve αfp.In ek olarak, Western blot analizi ile ifade edilen proteinlerin immünsitokimya kültürdeki hücre RT-PCR sonuçları teyit etmek için kullanılabilir içeren gen ekspresyon analizi daha geniş bir aralıkta bulunmaktadır.
Unutulmaması gereken bir konu Biz artık rutin stellat hücreleri belirteçleri (Sorun Giderme bölümüne bakınız) yönelik örnekler taranması 25. Karaciğer yıldızsı hücreleri üzerinde CD133 ekspresyonu tespit son eseridir ve kimliği yokBizim kesirler önemli kontaminasyon yazısından. Bu karaciğer sindirim ve hücre izolasyonu farklı teknikleri. 2,3,26 ilgili olabilir
Hücrelerin çoğunluğu hemen FACS izolasyon sonrasında uygulanabilir olmayacağı gerçeğine dayanarak, biz hayvanlarda kullanmadan önce, toplu CD133 + hücreleri veya tek hücre şeklinde, ya hücreler kaplı olmasını öneririz. In vitro 5-7 gün anlamlı tümörü analiz sonuçları iyileştirecektir. Koloniler toplu CD133 + izole hücrelerinden açılabilir kez ek olarak, tek bir hücre izolasyonu zorluklarına verilen, bu yalnızca yapılmalıdır. Kültür karaciğer kök ve progenitör hücreler için kullanılan olabilir, çeşitli kültür koşulları ve iskele proteinlerinin bir daha kapsamlı bir tartışma sıra Lola Reid ile karakterize edilmiştir. Bu çalışma temel izolasyon teknikleri öğrenilebiliyor kez araştırmacıların kendi araştırma programı içine dahil olabilir alternatif koşulları ve değişiklikler sağlar. 27,28 Dr Reid kelk da karaciğer kök hücreleri ve kararlı ataları arasında soy biyoloji ve olgunlaşma daha ayrıntılı bir analiz sunmaktadır.
In vivo tümör analizi açısından, öncelikle 1×10 6 hücre kullanılarak, in vitro klonal genişletti CD133 + hücreleri taze izole hücreler ve hücreleri kullanılarak başarı oldu. / – – Ve karaciğer özel PTEN – / – Biz kronik karaciğer hasarının ontwo genetik suşları, MAT1a odaklanmıştır fareler ve biz çıplak farelerin ve tümör büyümesi için hosts olarak wild-tip farelerden iki faydalanmış. Onlar pre-malign belirgin karaciğer hasarı modellerinde izole ise bizim deneyimlerimize göre, CD133 + karaciğer kök hücreleri sadece tümörleri oluşturacaktır. Unutmayın CD133 oluşan tümörler + hücrelerin genel tümörleri için bir kök hücre veya progenitör hücre kökenli düşündüren, hepatoselüler karsinom ve kolanjiokarsinom özellikleri de var. 2-4,29
Tümörler sonra takip çalışmaları inclu belgelenmiştirdes standart tümör dokusunun patolojik analizi (H & E boyama) ve immünohistokimyasal boyama. Buna ek olarak, tümörler FACS analizi ya da yeniden kültür için kıyılmış ve sindirilebilir. 2-4,30
Sonuç olarak, biz CD133 + karaciğer kök hücreleri ve CD133 + kanser kök hücrelerinin izolasyonu, genişleme, ve temel karakterizasyonu için bir prosedür detaylandırılmıştır.
Çekim Trouble:
CD45 kontaminasyon:
Önceki FACS analizi ve izolasyon bir CD45-FITC Ab ekleyerek değerlendirilebilir CD45 + hücreleri, kirlenme varsa Adım 3 için, CD45 antikoru microbead süresinin dolmadığından emin olmak için kontrol edin ve süzüntü toplandı sadece ederken filtre manyetik tutucu idi. Filtre manyetik tutucu CD45 + hücreler içerir değilken herhangi bir süzüntü toplanır.
Düşük hücre sayısı:
Yaralanmamış karaciğer, toplam numbe içinCD133 r + non-parankimal izole 10.000 daha az olabilir. Bu hücreler sakin karaciğerde nadirdir. Bu tür DDC% 0.1 diyet gibi bir kronik yaralanması modeli için, 100.000 hücre sayısı önemli ölçüde artacaktır. Toplam hücre sayısı önemli ölçüde bu sayıların altında ise, dikkate alınması gereken bir konu FACS Ab boyama olduğunu. Yoksul boyama yoksul bir randıman vereceğini gibi, CD133 Ab dolmamış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Ayrıca, biz FACS izolasyon açmadan önce göreli nüfusu belirlemek için karaciğer dışı parankimal hücreler FACS analizi gerçekleştirerek öneririz.
FACS sonrası Düşük hücre canlılığı:
Canlılığının konulardan biri hücreleri nasıl işlendiğini bağlı ve ne zaman içinde. Olabilir İdeal olarak, tüm hücre izolasyon prosedürü, 1-4 adımları, adımlar arasındaki herhangi bir gecikme olmadan yapılmış ve aynı gün içinde tamamlanması gerekir. 1-4 adımları arasında herhangi önemli bir gecikme büyük ölçüde hücre canlılığı azaltacaktır. C ile ilgili ikinci bir konuell canlılığı FACS izolasyonu için kullanılan kılıf basıncı ile ilişkili olabilir. Biz daha düşük bir kılıf basınç kullanmanızı öneririz. Hücreler izole edilir kez sıralama sonrasında buz üzerinde önemli bir depolama alanı da canlılığı azaltacaktır gibi Son olarak, onlar, hemen kaplı olmalıdır.
CD133 + non-parankimal heterojenite:
Son raporlar hepatik stellat hücreler de CD133 ekspresyonu ve bazı plastisite var olabileceğine işaret etmektedir. Dolayısıyla 25, Albumin ve Krt19, ek doğrulama ile iki potens genleri doğrulayan ek olarak bu tür glial fibriler asidik protein olarak stellat hücreler ile ilişkili genlerin, içerebilir hareketsiz stellat hücreleri ve aktive edilmiş hücreler stellat ve alfa-aktin ve desmin. 3,4,26 Buna ek olarak, CD133 + nüfusun daha geniş bir projenitör nüfus temsil eder. Böyle EpCAM gibi ikinci bir işaretçi, ve aynca nüfus düzeltilmesine yardımcı ve sınır heterojenite olabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Rountree Çocuk Miracle Network, Ulusal Sağlık Enstitüsü, K08DK080928 ve R03DK088013 ve Amerikan Kanser Derneği Araştırmacı Ödülü, MGO-11651 akımı desteğini onaylar. Dr Rountree Pediatrik Scientist Kalkınma Programı (NICHD Hibe Ödülü K12-HD00850) tarafından finanse yaparken bu işlemi başlangıçta geliştirilmiş ve rafine edilmiş olduğunu kabul eder.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
| CD45 microbeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E4127 | |
| DNase | Sigma | DN25 | 1 gram |
| Collagenase D | Roche | 1088874 | |
| Pronase | Roche | 0165921 | |
| 70 micron mesh strainer | Fisher | 352350 | |
| Omniscript RT | Quaigen | 205111 | 50 reactions |
| HotStarTaq | Quaigen | 203203 | |
| Miltenyi LD column | Miltenyi | 130-042-901 | |
| CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
| Laminin coated plates | BD | 354410 | 96 well |
| Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
| RNeasy Micro Kit | Quaigen | 74004 | 50 columns for 5×105 cells or less |
| Pharm Lyse | BD | 555899 | 10X concentration |
References
- Rountree, C. B. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).
- Ding, W. CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis. Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).
- Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice. Stem Cells. 27, 290-299 (2009).
- Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice. Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, 45-53 (2006).
- Theise, N. D. Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).
- Wang, X. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).
- Greenbaum, L. E., Wells, R. G. The role of stem cells in liver repair and fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).
- Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).
- Khurana, S. Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury. J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).
- Sell, S., Leffert, H. L. Liver cancer stem cells. J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).
- Lee, J. S. A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells. Nat. Med. 12, 410-416 (2006).
- Sell, S., Dunsford, H. A. Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma. Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).
- Amin, R., Mishra, L. Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis. Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).
- Tang, Y. Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling. Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).
- Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma. Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).
- Rountree, C. B. Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration. Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).
- Shimano, K. Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1. Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).
- Suzuki, A. Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver. Hepatology. , (2008).
- Suzuki, A. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).
- Yamashita, T. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).
- Furuyama, K. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
- Kordes, C. CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells. Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).
- Berg, T. Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation. Hepatology. , (2007).
- Turner, R. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).
- Wang, Y. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
- Galicia, V. A. Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2. Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).
- Ding, W. Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion. Hepatology. 52, 945-953 (2010).
