Isolement des cellules CD133 + Foie souches pour l'expansion clonale

Toutes les solutions, les médias, les instruments, les filtres et les tubes doivent être stériles et manipulés avec une technique stérile afin de réduire le risque de contamination. Préparer tous les tampons et les médias 24 heures à l'avance et les conserver à 4 ° C. 1. La séparation du parenchyme et non parenchymateuses du foie entier Préparer la solution enzymatique pour la digestion en utilisant un tube de 15 cc avec bouchon à vis en 10 ml de PBS stérile contenant 5 mg collagénase, 5 mg pronase, et 1 mg DNAse. Euthanasier souris en utilisant établissement agréé (Institutional Animal Care et du Comité Utilisations) la méthode comme le CO 2 asphyxie. Essuyez la zone abdominale des animaux euthanasiés avec une solution d'éthanol à 70%. Utiliser des instruments stériles, de la cavité abdominale ouverte et le foie explant en-bloc. Retirer de la vésicule biliaire du foie explanté. Transfert du foie entier pour hotte à flux laminaire dans un plat stériles fermés. Cette procédure est terminée en une hotte à flux laminaire. En utilisant une lame de rasoir stérile, mâche du foie avec la combinaison de multiples coupes horizontales et verticales pendant 1 minute dans un plat stérile. Placer ¼ de pâte de foie émincé dans 15 cc avec tube de 10 ml de PBS avec de la collagénase, la pronase et DNAse partir de l'étape 1.1 ci-dessus. Répétez l'opération avec chaque foie émincé ¼. Placer les tubes avec ¼ de pâte de foie haché et des enzymes dans le bain d'eau à 37 ° C pendant 45 minutes, avec agitateur à 1-2 cycles / seconde. Essuyez les tubes avec de l'éthanol à 70% après le retrait du bain d'eau avant le transfert vers une hotte à flux laminaire. Cette procédure est terminée en une hotte à flux laminaire. Strain pulpe du foie digérés par 70 mailles microns de recueillir dans un plat stérile. Utiliser aliquots de 2 ml de solution stérile DMEM: F12 médias avec inactivé par la chaleur 10% de sérum de veau fœtal, rincez le filtre et l'utilisation à la fin de caoutchouc d'un piston de la seringue pour écraser la pulpe digérées à travers le filtre. Répéter 5 fois pour faire du volume total de filtrat environ 20 ml. Divisez le filtrat en 2 tubes de 15 ml d'égalité. Tous les transferts devrait être achevé en hotte à flux laminaire, et l'utilisation centrifugeuse réfrigérée à 4 ° C si elle est disponible. Centrifuger à 50 xg pendant 1 minute. Enregistrer surnageant # 1 et jetez parenchyme granulés. Centrifuger le surnageant # 1 à 50 xg pendant 1 minute. Enregistrer surnageant # 2 et jetez granulés. Centrifuger le surnageant # 2 à 50 g pendant 1 minute. Enregistrer surnageant # 3 et jetez granulés. Centrifuger le surnageant finale # 3 pour 180 g pendant 8 minutes pour obtenir non parenchymateuses fraction. 2. Lyse des globules rouges Travailler dans une hotte à flux laminaire, garder les cellules froides, et les solutions utilisent refroidi à 4 ° C. La nuit avant la procédure, préparer rouges tampon de lyse cellulaire par dilution de la concentration des stocks 10X BD Pharm Lyse tampon avec une dilution 1:10 avec de l'eau distillée stérile. 1X solutionshould être stockées pendant 30 jours à 4 ° C. La nuit avant la procédure, préparer tampon Miltenyi utilisant PBS stérile, 0,5% de sérum albumine bovine, et 2mm d'EDTA. Solution de filtre à l'aide d'aspirateur filtre avec filtre de 0,45 micron. Couverture haut de l'appareil basculeur avec couvercle en plastique originale et sécurisée avec une pellicule de plastique. Storeentire unité de filtre à 4 ° C pendant 12 heures pour dégazer l'EDTA. Unité de filtrage peut être remplacé avec bouchon stérile standard après 12 heures. Cette procédure est terminée en une hotte à flux laminaire. L'utilisation d'un tube de 5 ml stériles, rétablir la suspension non parenchymateuses granules de l'étape 1.6 ci-dessus dans 1 ml de tampon dilué 1X rouge sang lyse cellulaire de 2,1 ci-dessus. Boucher le tube pour le transfert hors de la hotte à flux laminaire. Doucement vortex pour 5 secondes et incuber pendant 15 minutes à 4 ° C à l'abri de la lumière. Centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. Cette procédure est terminée en une hotte à flux laminaire. Jeter les globules rouges lysés dans le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon Miltenyi glace froide et stérile. Centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. Cette procédure est terminée en une hotte à flux laminaire. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon Miltenyi glace froide et stérile. Retirer 10 pl de suspension cellulaire PBS et ajouter 10 ul Tryan bleu. Comptez-parenchymateux remainingnon cellules en utilisant hémocytomètre. 3. CD45 déplétion des cellules hématopoïétiques de la fraction non parenchymateuses Travailler dans une hotte à flux laminaire, garder les cellules froides, et les solutions utilisent refroidi à 4 ° C. Suspendre les cellules dans 100 ul de tampon Miltenyi par 107 cellules jusqu'à 108 cellules totales. Appliquer 20 uL Miltenyi CD45 microbille pour chaque 107 cellules et incuber à 4 ° C pendant 15 minutes. Ajouter 2 ml supplémentaires Miltenyi tampon et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. Retirer le surnageant. Re-suspendre le culot cellulaire (jusqu'à 108 cellules au total) dans 1 ml de tampon Miltenyi. Dans hotte à flux laminaire, les cellules du filtre à l'aide Miltenyi LD colonne magnétique. Commencez par placer la colonne dans le support magnétique (MidiMACS Miltenyi ou QuadroMACS). Placez stériles de 5 ml tube-dessous du filtre pour attraper filtrat. Préparer la colonne en chargeant Milte 2 mlnyi tampon. Une fois pré-filtre de lavage est terminé, charger les cellules sur la colonne LD. Une fois la suspension cellulaire est dans la colonne, ajouter 1 ml de tampon Miltenyi et répétez 1 ml de tampon de lavage Miltenyi 2 fois supplémentaires. NE PAS utiliser le piston fourni avec colonne pour augmenter la vitesse de filtration. Ne recueillir filtrat lorsque le filtre placé dans le support magnétique. Centrifuger le filtrat recueilli d'environ 5 ml (la colonne détient la participation restante de 1 ml) de CD45-appauvri non parenchymateuses cellules à 200 xg pendant 5 minutes. Jeter la colonne avec le CD45 conservé cellules positives. 4. L'isolement cytométrie de flux de cellules positives CD133 Préparez le support de cellules ovales. Utilisez 01h01 milieu DMEM: F12 avec inactivé par la chaleur du sérum de veau foetal 10% comme base, et ajouter de l'insuline (1 pg / ml), HEPES (5 mol / L) et pénicilline / streptomycine (1% en volume / volume). Solution de filtre à l'aide d'aspirateur filtre avec filtre de 0,45 micron. Re-suspendre les cellules dans un tampon de Miltenyi à 100 ul par 10 7 cellules. Ajouter 2 ul de CD133-PE anticorps conjugués. L'utilisation d'un deuxième groupe de cellules, incuber avec des IgG-PE anticorps conjugué comme un contrôle. Conservez un troisième groupe de cellules sans coloration comme un contrôle non coloré pour FACS. Incuber à 4 ° C pendant 15 minutes dans l'obscurité. Re-suspendre en 2 ml tampon de coloration. Centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon Miltenyi. Cette étape est réalisée en utilisant la norme de débit des procédures de tri cellulaire par cytométrie, qui peuvent être spécifiques institution. En utilisant des cellules non colorées et IgG cellules PE tachés, ajuster les paramètres pour le tri gating optimisée de CD133 + population de cellules. PE (R-Phytoerythrin) peuvent généralement être utilisés avec n'importe quel cytomètre en flux qui a un laser qui émet à 488 nm. Le pic d'émission pour le PE est de 575 nm et est détecté dans le canal FL-2. Remarque: L'utilisation d'un BD ou BD FACS Calibur FACS Vantage machines, avec le programme Cell Quest pour la collecte des données, nous utilisons Vue avant Scatter Scatter et secondaires dans l'échelle logarithmique pour identifier les populations de cellules, avec la diffusion latérale à 250. FL1 et FL2 sont à la fois en échelle logarithmique et mettre à 550. Ces paramètres fournissent un lieu de départ initial pour voir le foie non parenchymateuses cellules, et sont ajustés au besoin basée sur l'intensité de coloration des populations positives et négatives. Isoler la population CD133 + cellule en utilisant CD133 + porte et de recueillir les cellules de milieux stériles cellulaire filtré. 5. Les méthodes de culture cellulaire Centrifuger les cellules FACS recueillies à 200 xg pendant 5 minutes. Re-suspendre le culot cellulaire dans les médias cellules ovales, avec environ 5000 cellules par ml. Peut commencer avec des concentrations plus élevées, jusqu'à 50 000 cellules / ml pour les premières expériences, et de réduire en améliore la technique et la viabilité cellulaire et améliore le rendement global. Cellules plaque sur BD Biocoat laminine revêtement des plaques de 96 puits à l'aide 1000 cellules / cm 2. Placer dans humidifié incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5% de CO 2. Après 24 heures, ajouter le facteur de croissance des hépatocytes (50 ng / nl) et facteur de croissance épidermique (20 ng / ml). Pour des cellules individuelles, d'isoler les cellules directement dans 50 ul de médias cellules ovales dans chaque puits d'une 96 puits laminine plaque revêtue. Utiliser une seule cellule FACS paramètres de sélection rigoureuse d'une cellule positive uniquement. Après 24 heures, ajouter 50 ul de médias cellules ovales avec HGF et EGF comme ci-dessus à l'étape 5.2. Changement des médias totalement après 5-7 jours. Une fois les colonies en expansion sont supérieurs à 50% confluentes, qui survient habituellement après 2 semaines, selon le nombre total de cellules plaqué et la viabilité cellulaire, les cellules peuvent être réparties comme ci-dessous 01h03. Fractionner les cellules en utilisant la trypsine 0,05%-EDTA. Appliquez juste assez pour couvrir de fond de puits, 50-100 ul / puits sur la plaque de 96 puits. Placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 3-5 minutes. Ajouter 100 uL de médias dans chaque puits et le transfert de tous les liquides à 5 ml tube. Ajouter 1 ml de milieu dans chaque tube et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. Re-suspendre les cellules dans la plaque de médias dans la laminine plat revêtu, en utilisant des cellules de 1 et à l'assiette en 3 nouveaux puits (ratio 1:3). 6. Confirmation de la bi-potentiel de l'état en utilisant la RT-PCR Cette procédure est détaillée dans le manuel de RNeasy protocole, qui est fourni avec le kit RNeasy. Utilisez RNeasy colonnes micro pour 96 colonies de plaques à puits. Aspirer des milieux de culture de chaque puits. Ajouter 75 ul tampon RLT (du kit RNeasy) directement à chaque puits. Plaque inférieure Gratter avec spatule en caoutchouc stérile. Pipettelysate en micro-tube à centrifuger et le mélange au vortex pendant 1 minute. Ajouter l'éthanol à 70% à lysats et mélanger par pipetage. Transférer la solution à la colonne RNeasy placée dans un tube collecteur de 2 ml (comme fourni dans le kit RNeasy) et centrifuger dans des micro-centrifugeuse pendant 15 secondes à 10000 rpm. Jeter élué filtrat. Réutilisation du tube de collecte. Ajouter 350 pi de tampon RW1 (RNeasy Kit) dans la colonne RNeasy et centrifuger pendant 15 secondes à 10000 rpm pour laver la colonnemembrane. Jeter lavez éluées. Ajouter 10 uL solution de DNase I à 70 pi de tampon RDD (tous deux fournis dans le kit RNeasy). Ajouter 80 ul du tampon DNase I mélange d'incubation RDD à la membrane colonne RNeasy et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter 350 pi de tampon RW1 (RNeasy kit) à la colonne RNeasy et centrifuger pendant 15 secondes à 10000 rpm pour laver la membrane. Jeter lavez élue et le tube collecteur. Placer la colonne RNeasy dans un nouveau tube collecteur de 2 ml (fourni dans le kit RNeasy). Ajouter 500 pi de tampon RPE (RNeasy Kit) dans la colonne RNeasy et centrifuger pendant 15 secondes à 10000 rpm pour laver la membrane. Jeter lavez éluées. Préparer l'éthanol à 80% en utilisant l'eau sans RNase (RNeasy Kit). Ajouter 500 ul d'éthanol à 80% à la centrifugeuse columnand RNeasy pendant 2 minutes à 10000 rpm. Jeter lavez éluées. Placer la colonne RNeasy dans un nouveau tube collecteur de 2 ml (RNeasy Kit) et centrifuger à pleine vitesse pendant 5 minutes. Jeter tout laver élue et le tube collecteur. Placer la colonne RNeasy dans un nouveau tube collecteur de 1,5 ml (kit RNeasy). Ajouter 14 uL d'eau sans RNase (RNeasy Kit) dans le centre de la membrane de la colonne et centrifuger pendant 1 minute à pleine vitesse. Recueillir le filtrat avec l'ARN purifié et le transfert à la glace en cas de création d'ADNc immédiatement ou conserver au moins 80 ° C pour une utilisation future. La transcription inverse en utilisant Omniscript.Dilute inhibiteur de RNase à une concentration finale de 10 unités / uL dans glacée RT 1x tampon. Vortex pendant 5 secondes, et centrifuger impulsions pendant 5 secondes. Préparer un master mix frais sur la glace en fonction de la page 13 de Omniscript protocole. Vortex pendant 5 secondes, et centrifuger impulsions pendant 5 secondes. Recommander à préparer un volume de mastermix 10% supérieure à celle requise pour le total requis pour toutes les réactions. Ajouter ARN modèle pour les tubes individuels contenant mélange maître. Vortex pendant 5 secondes, et centrifuger impulsions pendant 5 secondes. Incuber pendant 60 min à 37 ° C. L'amplification par PCR des hépatocytes (albumine) et cholangiocytes gènes spécifiques en utilisant l'ADN polymérase HotStarTaq. Préparer le mélange de réaction par page 15 du protocole de HotStarTaq livre. Recommander diluer amorces d'actions à la concentration de 20 h / ul, et avec 1 ul / réaction tube utilisé pour amorces avant et arrière. Selon le nombre de cellules initialement utilisé pour l'extraction de l'ARN, nous recommandons divisant ADNc final entre 3 tubes de réaction (β-actine pour le contrôle du chargement, l'albumine, et KRT19) pour commencer. Conception d'amorce de PCR est indiquée au tableau 1. Placer les tubes de réaction dans un thermocycleur. Recommander programme suivant pour les premières expériences: 95 ° CFOR 15 minutes x 1 cycle suivi par 95 ° C pendant 30 secondes, 55 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 30 secondes x 35 cycles, suivis par 72 ° C pendant 10 minutes. Les produits de PCR sont analysés en utilisant le bromure d'éthidium imprégné gel d'agarose. 7. Confirmation du potentiel tumoral des cellules souches CD133 + Cette procédure peut être fait avec cellules fraîchement isolées de l'étape 4 ou en utilisant des cellules qui ont été cultivés à partir de l'étape 5. Nous vous recommandons d'effectuer les premières expériences avec des cellules cultivées, comme les cellules fraîchement isolées auront réduit la viabilité et le rendement réduit. Trypsiniser cellules à l'aide de trypsine-EDTA 0,05% de l'étape 5.5 ci-dessus. Après 3-5 minutes d'incubation à 37 ° C, ajouter 100 uL des médias dans chaque puits et le transfert de tout le liquide de chaque puits individuels aux tubes de 5 ml (1 bien = 1 tube). Ajouter 1 ml de milieu dans chaque tube et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. Re-suspendre les cellules dans 1 ml de PBS glacé. Retirer 10 pl de suspension cellulaire PBS et ajouter 10 ul bleu trypan. Utiliser exclusion du bleu trypan, déterminer le nombre de cellules vivantes. Si vous utilisez FACS des cellules isolées, le nombre de cellules est déterminé par le comte d'isolation par FACS. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 minutes et re-suspendues dans du PBS à une concentration de 1 x 10 6 vivons cellules/100 ul. Ajouter 100 ul Matrigel. Six semaines vieilles souris immunodéficientes Nude ont été injectées par voie utilisant l'aiguille 28 gague. Injecter 1 x 10 6 cellules dans 200 ul par site. Les souris sont surveillés pour la croissance tumorale quotidienne. Une fois les tumeurs forme, généralement après 3-4 semaines d'incubation, le volume tumoral est mesuré en utilisant des étriers (hauteur x longueur x largeur). 8. Les résultats représentatifs: De la normale, le foie murin sain, le rendement attendu cellulaire des cellules CD133 + tige de foie est de 1000 à 5000 par le foie. Ces cellules sont relativement rares dans le foie au repos et ne se développe pas bien dans la culture. Nous ne recommandons pas d'utiliser l'analyse seule cellule du foie normal et le rendement des cellules viables qui permettront d'élargir est extrêmement faible. Pour les foies avec des blessures chroniques importantes, telles que l'alimentation CDD de 0,1% pendant 6 semaines 1 ou modification génétique entraînant des blessures chroniques, comme l'MAT1a – / – ou Pten spécifique du foie – / – souris, 2-4 le nombre attendu de celaugmente ls isolés, avec un maximum de 100 000 cellules isolées / foie (figure 2). Si en utilisant des modèles génétiques, les savoirs du taux de tumeurs spontanées est critique, car ces procédures pour l'isolement des cellules du foie tige doit être réalisée dans les tumeurs des animaux libres. Par exemple, si l'MAT1a – / – modèles de formulaires tumeurs spontanées à 18 mois, nous vous recommandons d'utiliser des animaux au plus tard 15-16 mois, préalable à toute tumeurs spontanées signalés. Isolement des cellules isolées à partir de modèles blessure chronique donnera plusieurs (3-9 colonies/96 plaque bien) qui étendent les colonies de cellules uniques une fois la procédure est maîtrisée, et la viabilité cellulaire est assurée. La figure 3 présente des images à contraste de phase représentative des colonies issues de simples cellules CD133 + élargi après 7 jours. Confirmation de la bi-potentiel d'état est effectuée à l'aide d'albumine et de Krt19 RT-PCR. Colonies de cellules élargi unique de démontrer à la fois l'expression des marqueurs des hépatocytes (albumine) et cholangiocytes (Krt19). La figure 4 montre le potentiel d'expression bi-à partir de trois colonies isolées, avec environ 25 cellules / colonie à 7 jours. CD133 + cellules souches du foie normal et des lésions hépatiques induites chimiquement (par exemple, la DDC alimentation de 0,1% pendant 6 semaines) ne seront pas former des tumeurs chez la souris nude. CD133 + cellules souches à partir de modèles spécifiques génétique (MAT1a – / – ou Pten spécifique du foie – / – souris) va former des tumeurs chez la souris nude, si isolée fin à la fin de la phase de pré-tumorale des blessures chroniques. Ce phénotype tumoral formant actuellement identifié comme une cellule souche du cancer 2-4 Pour exemple, le MAT1a -. / – Souris former des tumeurs du foie spontané à 18 semaines d'âge. CD133 + cellules souches hépatiques isolées à 15-16 semaines, lors d'une phase de blessure chronique tardive de la maladie du foie, va former des tumeurs chez la souris nude. La figure 5 montre les tumeurs représentant de l'injection bilatérale de 1 x 10 6 cellules élargi in vitro à partir des cellules simples + CD133 souches hépatiques. Gene Amorce sens Amorce antisens β-actine 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' L'albumine 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' Kératine 19 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' Tableau 1: conception d'amorce pour la RT-PCR Figure 1: Schéma global des méthodes. Figure 2: CD133 + cellules souches identifiées dans le foie hautement enrichi CD45 appauvri non parenchymateuses du foie fraction de contrôle indemne de souris de type sauvage démontre 0,4% des cellules CD133 + dans le CD45 hautement enrichi appauvri non parenchymateuses fraction.. Dans la génétique knock-out MAT1a – / -, qui est un modèle de lésion hépatique chronique, la population augmente de 10 fois CD133 ou plus dans la même fraction hautement enrichi. Figure 3: Expansion des colonies de cellules CD133 + simple clones en contraste de phase des images de quatre colonies dérivées de cellules CD133 + simple élargi sur la laminine revêtement des plaques 96 puits.. Figure 4:. Expression des gènes potentiels de Bi-CD133 + cellule souches hépatiques colonies clonale élargi au jour 7, les colonies sont d'environ 25 cellules. L'expression des gènes démontre l'expression de marqueurs marqueurs hépatocytaires et de l'albumine cholangiocytes Krt19, confirmant bi-potentiel statut de cellules CD133 +. Figure 5: CD133 + cellules souches du foie former des tumeurs chez la souris nude Les flèches indiquent les tumeurs à croissance de 4 semaines après 6 cellules CD133 + 1×10 injectés à partir MAT1a – / – modèle.. CD133 + cellules de la toxine du foie blessures induites chroniques, tels que CCl 4 ou 0,1% DDC alimentation, ne pas former des tumeurs. La formation des tumeurs est utilisé pour identifier un potentiel malin, ou le phénotype des cellules souches cancéreuses au sein de la population de cellules souches.