عزل CD133 خلايا + الجذعية الكبد للتوسع نسيلي
Summary
نحن هنا وصف عزل الخلايا الجذعية CD133 معربا عن الكبد والخلايا الجذعية السرطانية من الكبد الفئران كله، وهي عملية الهضم يتطلب الأنسجة، والإثراء الخلية، وتدفق الخلوي العزلة. نحن تشمل أساليب متقدمة لعزل خلية واحدة والتوسع نسيلي.
Abstract
الكبد الخلايا الجذعية، أو الخلايا البيضاوي، تتكاثر خلال إصابة الكبد المزمن، واقترح على التمايز إلى خلايا الكبد على حد سواء وcholangiocytes. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الافتراض الكبد الخلايا الجذعية لتكون السلائف لمجموعة فرعية من سرطان الكبد، سرطان الكبد. واحدة من التحديات الرئيسية لوقف العمل في أي خلية الأعضاء الصلبة مثل الكبد هو عزل السكان نادرة من الخلايا لتحليل مفصل. على سبيل المثال، فإن الغالبية العظمى من الخلايا في الكبد هي خلايا الكبد (جزء متني)، والتي هي أكبر بكثير من الخلايا غير متني. من إثراء حجرات محددة الخلوية في الكبد (أي متني والكسور غير متني)، واختيار لخلايا CD45 السلبية، ونحن قادرون على إثراء السكان بدءا من الخلايا الجذعية أكثر من fold.The-600 proceduresdetailed في هذا التقرير يسمح لل يمكن فرز عدد سكانها نادرة نسبيا من الخلايا من الأعضاء الصلبة بكفاءة. ويمكن استخدام هذه العملية لisolateliالخلايا الجذعية النسخة من الكبد الفئران العادية وكذلك نماذج اصابة الكبد المزمنة، والتي تثبت زيادة انتشار الخلايا الجذعية الكبد. هذا الأسلوب له مزايا واضحة على مستوى الكبد المناعية الثابتة المجمدة أو الفورمالين كما يمكن إجراء الدراسات الفنية باستخدام الخلايا الحية بعد التجارب الأولية شارك في الترجمة. لإنجاز إجراءات المبينة في هذا التقرير، وتشجع بقوة على علاقة عمل مع مجموعة أساسية التدفق الخلوي البحوث القائمة على المعلومات من العزلة FACS تعتمد اعتمادا كبيرا على الأجهزة المتخصصة ومعرفة قوية تعمل من إجراءات التدفق الخلوي الأساسية. الهدف المحدد لهذه العملية هو عزل السكان من الخلايا الجذعية الكبد التي يمكن توسيعها clonally في المختبر.
Protocol
Discussion
وخلافا للنظام المكونة للدم، والخلايا الجذعية المكونة للدم والتي هي المسؤولة عن الحفاظ على نظام تمايز الخلايا التي replacesnormal الفسيولوجية تسليم أكثر من الكريات البيض، وخلايا الدم الحمراء، والصفائح الدموية والكبد الخلايا الجذعية، أو الخلايا الاصلية الكبار الكبد، لا تشارك في الكبد طبيعية التوازن. 5،6 بعد اصابة الكبد الحاد أو استئصال الكبد الجزئي، خلايا الكبد، والكبد ظهارة متباينة، والخضوع عدة جولات من الانتشار الشامل لتحل محل الكبد المفقودة. 5،6 فقط خلال الإصابة المزمنة هي الخلايا الجذعية الكبد لوحظ في الانتشار. 1،5 وتقترح هذه -11 الكبار، وخلايا جذعية محددة الجهاز على التمايز إلى خلايا الكبد على حد سواء وcholangiocytes. 1،5-8 ومن المثير للاهتمام، أن الغالبية العظمى من سرطان الكبد يتطور على خلفية إصابة مزمنة، وبالتالي يتم الافتراض أيضا الخلايا الجذعية لتكون الكبد السلائف لمجموعة فرعية من سرطان الكبد. 2-4،12-17
Oشمال شرق التحديات كبيرة لوقف العمل في خلية الكبد هو عزل السكان نادرة من الخلايا لتحليل وظيفي. على سبيل المثال، فإن الغالبية العظمى من الخلايا في الكبد هي خلايا الكبد، والتي هي أكبر بكثير من cholangiocytes وأصغر الخلايا الأخرى غير متني. عن طريق كسر الكبد كله الى حجرات خلية (خلايا الكبد كبيرة – جزء متني وأصغر الخلايا – غير متني آسر)، وأخرى لاختيار الخلايا CD45 السلبية (غير المكونة للدم الخلايا)، ونحن قادرون على إثراء السكان بدءا من الخلايا الجذعية أكثر من مرة-600. 1،18-21 وتجدر الإشارة، ونحن بأي حال من الأحوال مشيرا إلى أن السكان + CD133 هو 100٪ نقية الخلايا الجذعية السكان، لكنها تمثل بوضوح السكان غير متجانسة من الخلايا، مع نسب مختلفة وإمكانية إعادة تعمير. واحدة من العوائق الرئيسية الحقل هو تعريف الخلايا الجذعية والخلايا الاولية. نستخدم مصطلح "الخلايا الجذعية" على نطاق أوسع في هذا العمل، ولكن في التعريف الدقيق، CD133 + غير parenc- الخلايا hymal تمثل السكان السلف ثنائية النسب. نظرا لحالة الجذعية الحالية والبحوث السلف في الكبد، فإن هذا التقرير لا توفر مكان انطلاق لالمحققين الذين يهتمون في هذا المجال. كما يمكن علامات جديدة تظهر، مثل EpCAM، أو 22،23 عوامل النسخ، مثل Sox9، 24 إدراجها. على سبيل المثال، وجدنا نسبة عالية إلى حد ما من التداخل بين الخلايا والخلايا + + EpCAM CD133.
في هذا التقرير، إلا أننا التفاصيل عملية لعزل الخلايا الجذعية من الكبد الفئران العادية وكذلك نماذج اصابة الكبد المزمنة، التي تبين زيادة انتشار الكبد الخلايا الجذعية. هذا الأسلوب له مزايا واضحة على مستوى الكبد المناعية الثابتة المجمدة أو الفورمالين كما يمكن إجراء الدراسات الفنية باستخدام الخلايا الحية بعد العزلة. 1،3،4 الهدف المحدد لهذه العملية هو عزل السكان نقية نسبيا من الخلايا الجذعية التي يمكن أن الكبد يمكن توسيع clonally في المختبر.
<p cمعشوقة = "jove_content"> والقيد الرئيسي لهذا الإجراء هو أن غالبية خلايا معزولة لن تكون قابلة للحياة بعد التدفق الخلوي (انظر القسم المتاعب رماية). هذا هو نتيجة لساعات اللازمة لإعداد الخلايا، والإجراءات اللازمة لصقل العديد من السكان قبل العزلة. إذا هضم الكبد في تعليق خلية واحدة لتحليل FACS الفوري، والفرق بين حجم خلايا الكبد وخلايا أخرى غير متني تفعيل إنشاء بوابة FACS مستحيلا. إذا تستخدم الكبد غير متني الخلايا، دون القضاء على الخلايا المكونة للدم، وهناك خطر يتمثل في أن عددا كبيرا من الخلايا CD133 + قد تكون ذات المنشأ المكونة للدم قد تلوث الكسر. وعلاوة على ذلك، عن طريق معالجة خلايا من خلال تصفية Miltenyi، يتم جمع الخلايا فقط واحد ومجموعات صغيرة جدا من الخلايا. وهذا يضمن أن العينة لن تسد الإبرة تناول FACS.بدائل لهذا الإجراء تشمل مodification لأي علامة الخلية السطحية البديلة، مثل CD49f، EpCAM، أو مزيج من علامات، مثل CD133 + + A EpCAM نشر التقرير الثاني يستخدم التدرج الكثافة لعزل الخلايا الجذعية من الكبد جزء غير متني. هذا الإجراء يتطلب وجود أجهزة الطرد المركزي فائقة (8000 XG)، ويضيف وقتا كبيرا لهذا الإجراء، وتجربتنا، انخفاضا كبيرا قبل FACS العائد الخلوية وقدرتها على البقاء بعد FACS .. 8
التجارب في المستقبل تشمل مجموعة أوسع من تحليل التعبير الجيني، بما في ذلك الجينات الكبد الجنين، مثل HNF3، HNF4α، وبالإضافة إلى ذلك αfp.In، تحليل لطخة غربية ويمكن استخدامها كيمياء سيتولوجية مناعية للبروتينات وأعرب لتأكيد RT-PCR النتائج من الخلايا في الثقافة.
قضية واحدة هو أن نلاحظ أن الأعمال الأخيرة التي تم تحديدها CD133 التعبير على الخلايا النجمية الكبدية 25 ونحن الآن فحص روتيني لدينا عينات من علامات الخلايا النجمية (انظر القسم المتاعب الرماية)، وليس لديها معرفentified تلوث كبير في الكسور لدينا. قد يكون ذلك متعلقا تقنيات مختلفة من الهضم الكبد والعزلة الخلية. 2،3،26
استنادا إلى حقيقة أن غالبية الخلايا لن تكون قابلة للحياة على الفور بعد العزلة FACS، من المستحسن أن تكون الخلايا مطلي، إما معظم الخلايا CD133 + أو الخلايا واحدة، قبل استخدامها في الحيوانات. سوف 5-7 أيام في المختبر تحسن إلى حد كبير نتائج تحليل الورم. وبالإضافة إلى ذلك، وبالنظر إلى قسوة العزلة خلية واحدة، ينبغي أن تجرى إلا مرة واحدة هذا ويمكن توسيع المستعمرات من CD133 + جل الخلايا المعزولة. وقد تم مناقشة أشمل لمختلف الظروف الثقافة والبروتينات التي يمكن أن سقالة تستخدم لالجذعية الكبد الثقافة والخلايا الاصلية تتميز بشكل جيد من قبل لولا ريد. هذا العمل يوفر الظروف البديلة والتعديلات التي قد المحققين يدرج في برنامج أبحاثهم بمجرد يتقن تقنيات عزل الأساسية. 27،28 د. ريد العك كما يوفر تحليلا أكثر تفصيلا لعلم الأحياء ونسب نضوج الخلايا الجذعية بين الكبد والأسلاف ملتزمة.
من حيث تحليل الورم في الجسم الحي، ونحن حققنا نجاحا باستخدام الخلايا المعزولة حديثا والخلايا من الخلايا توسيع clonally + CD133 في المختبر، وذلك باستخدام أساسا 1×10 6 خلايا. فقد ركزنا سلالات ontwo الوراثية للإصابة الكبد المزمن، وMAT1a – / – وPTEN الكبد محددة – / – الفئران، ونحن على حد سواء استخدمت الفئران عارية والبرية من نوع الفئران باعتبارها الدولة المضيفة لنمو الورم. في تجربتنا، فإن CD133 + الجذعية الكبد الخلايا تشكل الأورام فقط إذا تم عزلها من النماذج الهامة التي هي إصابة الكبد قبل الخبيثة. لاحظ أن الأورام يتكون من خلايا CD133 + العامة على حد سواء سرطان الكبد سرطانة الأوعية الصفراوية والميزات، مما يشير إلى الخلايا الجذعية أو خلايا المنشأ السلف إلى أورام. 2-4،29
يتم توثيق أعمال المتابعة بعد أورام incluقصر معيار تحليل أنسجة الورم مرضية من (H & E تلطيخ) وتلطيخ المناعى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن مفروم الأورام وهضمها لتحليل FACS أو إعادة الثقافة. 2-4،30
في الختام، لقد فصلنا إجراء لعزل وتوسيع وتوصيف CD133 + الأساسية للخلايا الجذعية الكبد وCD133 + الخلايا الجذعية السرطانية.
متاعب إطلاق النار:
CD45 التلوث:
لخطوة 3، إذا كان هناك تلوث من الخلايا + CD45، والتي يمكن تقييمها من خلال إضافة آب CD45-FITC قبل FACS تحليل والعزلة، تحقق لضمان عدم صلاحية الأجسام المضادة microbead CD45 والتي تم تجميعها في الترشيح في حين فقط وكان مرشح في حامل المغناطيسي. أي جمع الراشح في حين أن المرشح هو ليس في حامل المغناطيسي سوف تحتوي على خلايا CD45 +.
انخفاض الخلية رقم:
للكبد لم يصب، ومجموع numbeقد ص CD133 + من غير معزولة متني يكون أقل من 10،000. هذه الخلايا هي نادرة في الكبد هادئة. لنموذج إصابة مزمنة، مثل اتباع نظام غذائي DDC 0.1٪، وزيادة عدد الخلايا إلى حد كبير إلى 100،000. إذا كان عدد الخلايا الإجمالي أقل بكثير هذه الأرقام، قضية واحدة للنظر هو تلطيخ أب FACS. تحقق لضمان عدم صلاحية أب CD133، وتلطيخ الفقراء سيؤدي إلى العائد الفقراء. أيضا، نوصي بإجراء تحليل FACS من الخلايا غير متني الكبد لتحديد السكان النسبي قبل محاولة FACS العزلة.
انخفاض بقاء الخلية بعد FACS:
قد تكون ذات صلة واحدة من القضايا ذات جدوى لكيفية معالجة الخلايا وأكثر من أي وقت من الناحية المثالية، ينبغي أن تتم بمعزل الخلية بأكملها الداخلي، الخطوات 1-4، دون أي تأخير بين الخطوات ويتم الانتهاء منها في نفس اليوم. فإن أي تأخير كبير بين الخطوات 1-4 يقلل كثيرا من بقاء الخلية. المسألة الثانية تتعلق جقد تكون ذات صلة الجدوى الذراع لضغوط غمد تستخدم لعزل FACS. نوصي باستخدام خفض ضغط غمد. وأخيرا، مرة واحدة يتم عزل الخلايا، ينبغي أن تكون مطلية على الفور، لأن أي تخزين كبيرة على الجليد بعد الفرز سوف يقلل أيضا قدرتها على البقاء.
CD133 + غير متني عدم التجانس:
التقارير الأخيرة تشير إلى أن الخلايا النجمية الكبدية قد يكون لها أيضا CD133 التعبير وبعض اللدونة 25 لذلك، بالإضافة إلى التحقق من فاعلية الجينات ثنائية مع التحقق، والزلال Krt19 إضافية يمكن أن تشمل الجينات المرتبطة الخلايا النجمية، مثل البروتين ييفي الحمضية الدبقية في الخلايا النجمية هادئة وسلسة ألفا أكتين العضلات والخلايا النجمية في desmin المنشط. 3،4،26 وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدد سكان + CD133 يمثل السكان أوسع السلف. إن إضافة علامة ثانية، مثل EpCAM، وتساعد على صقل المزيد من السكان، وعدم التجانس الحد.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدكتور Rountree يعترف الدعم الحالي من شبكة معجزة الأطفال، المعهد الوطني للصحة، وK08DK080928 R03DK088013، والجمعية الأميركية للسرطان بحوث جائزة الباحث، MGO-11651. الدكتور Rountree يعترف التي تم تطويرها في البداية هذا الإجراء وصقلها في حين تمول من برنامج عالم الأطفال التنمية (معاهد الصحة القومية منح جائزة K12-HD00850).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
| CD45 microbeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E4127 | |
| DNase | Sigma | DN25 | 1 gram |
| Collagenase D | Roche | 1088874 | |
| Pronase | Roche | 0165921 | |
| 70 micron mesh strainer | Fisher | 352350 | |
| Omniscript RT | Quaigen | 205111 | 50 reactions |
| HotStarTaq | Quaigen | 203203 | |
| Miltenyi LD column | Miltenyi | 130-042-901 | |
| CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
| Laminin coated plates | BD | 354410 | 96 well |
| Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
| RNeasy Micro Kit | Quaigen | 74004 | 50 columns for 5×105 cells or less |
| Pharm Lyse | BD | 555899 | 10X concentration |
References
- Rountree, C. B. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).
- Ding, W. CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis. Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).
- Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice. Stem Cells. 27, 290-299 (2009).
- Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice. Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, 45-53 (2006).
- Theise, N. D. Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).
- Wang, X. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).
- Greenbaum, L. E., Wells, R. G. The role of stem cells in liver repair and fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).
- Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).
- Khurana, S. Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury. J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).
- Sell, S., Leffert, H. L. Liver cancer stem cells. J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).
- Lee, J. S. A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells. Nat. Med. 12, 410-416 (2006).
- Sell, S., Dunsford, H. A. Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma. Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).
- Amin, R., Mishra, L. Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis. Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).
- Tang, Y. Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling. Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).
- Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma. Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).
- Rountree, C. B. Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration. Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).
- Shimano, K. Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1. Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).
- Suzuki, A. Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver. Hepatology. , (2008).
- Suzuki, A. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).
- Yamashita, T. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).
- Furuyama, K. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
- Kordes, C. CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells. Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).
- Berg, T. Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation. Hepatology. , (2007).
- Turner, R. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).
- Wang, Y. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
- Galicia, V. A. Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2. Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).
- Ding, W. Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion. Hepatology. 52, 945-953 (2010).
