Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d'un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l'immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n'importe quel type de cellule.
La capacité de l'étiquette de façon différentielle des cellules individuelles a des implications importantes en biologie du développement. Par exemple, pour déterminer comment hématopoïétiques, les lignages vaisseau lymphatique et sanguin surviennent dans les embryons en développement nécessite la cartographie destin et la lignée de traçage des cellules précurseurs indifférenciés. Récemment, des protéines photoactivables qui comprennent: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, pKindling 8 et 9 KikGR, 10 ont reçu un grand intérêt en tant que sondes de cellules de traçage. Le spectre de fluorescence de ces protéines photosensibles peuvent être facilement convertis avec excitation UV, permettant une population de cellules doit être distinguée de celles adjacentes. Cependant, le photoefficiency de la protéine activée peut limiter à long terme de cellules de suivi 11. Comme alternative aux protéines photoactivables, cage fluorescéine-dextran a été largement utilisé dans des systèmes modèles embryon 7, 12-14. Traditionnellement, pour uncage fluorescéine-dextran, l'excitation UV d'une lampe maison de fluorescence ou d'un laser seul photon UV a été utilisé, cependant, de telles sources de limiter la résolution spatiale de photoactivation. Nous rapportons ici un protocole de cartographier le destin, trace la lignée, et de détecter les simples cellules marquées. Les cellules individuelles dans les embryons injectés avec cage fluorescéine-dextran sont photoactivé avec des impulsions laser dans le proche infrarouge produite par un laser femtoseconde titane saphir. Ce laser est de coutume dans tous les microscopes à deux photons confocale tels que le microscope LSM 510 META RNL utilisées dans ce document. Depuis les tissus biologiques est transparent pour l'infrarouge proche d'irradiation 15, les impulsions laser peut être focalisé en profondeur au sein de l'embryon sans uncaging cellules au-dessus ou en dessous du plan sélectionné focale. Par conséquent, non-linéaire d'absorption à deux photons est induit seulement au foyer géométrique pour uncage fluorescéine-dextran dans une seule cellule. Pour détecter la cellule contenant Uncaged fluorescéine-dextran, nous décrivons un protocole d'immunohistochimie simples de 16 à visualiser rapidement la cellule activée. Le protocole d'activation et de détection présenté dans cet article est polyvalent et peut être appliquée à tout système modèle.
Remarque: Les réactifs utilisés dans ce protocole peut être trouvée dans le tableau annexé à la fin de l'article.
Ce document décrit une méthode polyvalente pour la cartographie de la cellule destin unique basé sur la photoactivation de cage fluorescéine-dextran. Uncaging des cages fluorescéine-dextran dans des cellules individuelles est réalisé en utilisant absorption à deux photons d'un laser femtoseconde Maï Taï couplé au microscope Zeiss LSM 510 META confocale. Uncaged fluorescéine-dextran dans les cellules photoactivé est rapidement visualisées en utilisant une technique immunohistochimique simple.
Dans ce protocole la longueur d'onde d'absorption à deux photons pour photoactivation de cage fluorescéine-dextran est de 740 nm. Cette longueur d'onde a été déterminée expérimentalement par photoactivating cage fluorescéine-dextran embryons de type sauvage injecté. La longueur d'onde d'excitation laser a été variée de 600 à 800 nm, et la présence ou l'absence de fluorescence de la fluorescéine après activation était qualitativement déterminé. Nous avons constaté que 740 nm produite l'activation du signal le plus fort fluorescéine suivants. Idéalement, 740 nm devrait fonctionner pour tous les systèmes de modèle, mais nous vous conseillons de tester un éventail de longueurs d'onde pour déterminer la longueur d'onde d'excitation optimale à deux photons pour votre échantillon.
En cage fluorescéine-dextran embryons de type sauvage injecté, pour chaque longueur d'onde d'excitation à deux photons testé nous avons également fait varier la puissance du laser en moyenne. Pour une longueur d'onde d'excitation de 740 nm, une puissance laser moyenne de 47 mW produit un signal fort à la fluorescéine région activée en comparaison à la baisse des puissances laser moyenne. Supérieur puissances laser moyen n'a pas de produire des signaux de fluorescéine plus fort, mais l'ablation des tissus induits. Depuis impulsions laser femtoseconde sont efficaces à l'ablation de tissus biologiques 15, nous recommandons de déterminer la puissance du laser seuil moyen pour la photoactivation qui évite l'ablation des tissus.
Absorption à deux photons se produit dans un volume faible interaction. Pour assurer l'activation correcte de cage fluorescéine-dextran, la cellule doit être mis en évidence appropriée. Dans le protocole ci-dessus, cellules GFP-positives ont été simultanément imagé sous la lumière blanche pour confirmer l'accent cellule. Par conséquent, l'acquisition de lumière blanche en plus d'autres canaux est conseillé. Après avoir confirmé l'accent cellulaire, notre protocole suggère grossissant la cellule activée. Un facteur de zoom de 50 à 70 est suggéré, toutefois, cette valeur dépend de la taille de la cellule choisie. Accroître le zoom isole les cellules activées par les cellules adjacentes, et les limites de la zone de numérisation pour les deux photons d'activation. Idéalement, la zone de numérisation devrait couvrir une grande surface de la cellule.
Détection de simples cellules activées exige que le bruit de fond minime. Dans le protocole ci-dessus immunodétection, il est important que l'échantillon est bloqué en tampon de blocage pendant 5 à 6 heures (étape 4.13). Lors du développement avec le NBT / BCIP, Uncaged fluorescéine-dextran devrait devenir visible dans 10 à 20 minutes. Si la coloration de fond est solide, nous proposons un temps plus long blocage et lavages supplémentaires pour retirer l'anticorps (étape 4.17).
Les figures 1 et 2 fournissent des résultats représentatifs de la photoactivation et immunodétection. Dans la figure 1, au début 1 – 2 cellules embryons au stade de type sauvage ont été injectés avec cage fluorescéine-dextran. Les embryons ont été soulevées à la mi somitogenèse et monté à faible fondre agarose dans l'orientation latérale. La figure 1 (a, b) dépeignent clair et des images fluorescentes de l'embryon avant photoactivation. Preuve que l'embryon est resté Uncaged est démontré par l'absence de fluorescéine fluorescence dans la figure 1 (b). Une petite région au sein d'un somite a été activé avec une longueur d'onde de 740 nm pendant 31 secondes en utilisant un laser de puissance moyenne de 47 mW, la figure 1 (c; flèche). Post-activation, à deux photons de la fluorescéine uncaging-dextrane produit comme indiqué par la fluorescence de la zone est activée, la figure 1 (d; flèche). L'activation n'a pas été accompagnée par ablation laser, comme le tissu somitique est restée intacte, la figure 1 (c). La figure 2 montre l'immunodétection de Uncaged fluorescéine-dextran. Une petite région dans le mésoderme de la plaque latérale d'un embryon au stade 10 somites a été photoactivé utilisant les paramètres du laser mêmes que ceux mentionnés dans la figure 1. L'embryon a été soulevée et traitées en utilisant les étapes 4.1 à 4.20. La flèche de la figure 2 localise la région activée, comme indiqué par l'accumulation de précipité bleu. Seul l'emplacement est clairement détecté activé sans interférer coloration de fond.
Préparation des solutions:
1 X PBT (1 L)
100 ml 10 X PBS
2 g de BSA
10 ml de Tween 20%
10 X PBS (1 L)
80 g de NaCl
2 g de KCl
6,1 g de Na 2 HPO 4
1,9 g de KH 2 PO 4
ddH 2 O à 1 L
pH à 7,3
Paraformaldéhyde à 4% (160 ml)
Paraformaldéhyde 32% (deux flacons de 10 ml)
8 ml 20 X PBS
132 ml ddH 2 O
Solution d'anticorps (pour 1 échantillon)
5,5 uL poudre acétonique
40 ul PBT
0.8 LS uL
0,1 uL anti-fluorescéine-AP d'anticorps
LS 2% (360 ul pour 1 échantillon)
7.2 LS uL à 100%
352,8 uL PBT
1 X Danieau médias (1 L) ‡
11,6 ml 5 M de NaCl
700 uL 1 M KCl
400 pi 1 M MgSO 4
600 pi 1 M Ca (NO 3) 2
5 ml 1 M HEPES
ddH 2 O à 1 L
pH 7,6 à s'adapter à
‡ Danieau est une solution idéale de sel pour l'élevage des embryons de poisson zèbre dechorionated. D'autres médias peuvent être utilisés, à condition qu'ils soient correctement avec des solutions isotoniques osmolarité (~ 300 mOsm pour le poisson zèbre)
NBT Stock (1 ml)
50 mg Nitro Bleu de tétrazolium
0,7 ml d'anhydride diméthyl formamide
0,3 ml ddH 2 O
BCIP stock (1 ml)
50 mg de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
1 ml d'anhydride diméthyl formamide
NBT / BCIP solution de développement
1 ml tampon AP
4,5 stock de NBT uL
3.5 Stock BCIP uL
Poudre acétonique
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions J. Chen pour fournir le protocole de synthèse en cage fluorescéine-dextran. Cette recherche a été soutenue par le Mars de la sentence Dimes 5-FY09-78, l'American Heart Association Award 09BGIA2090075, et le prix du NIH / NHLBI R01-01 à HL107369 SS Un merci spécial à C. Closson pour son aide microscopie.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
NBT | Sigma | I8377-250mg |
BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
LSM 510 META NLO | Zeiss | |
20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |