Визуализация вируса денге через Alexa Fluor маркировки
Summary
Воспользовавшись достижениями в флуорофора развития и технологий визуализации, простой метод Alexa Fluor маркировки вируса денге была разработана для визуализации ранних взаимодействий между вирусом и клетки.
Abstract
Ранние события во взаимодействии вируса и клетки может иметь существенное влияние на исход инфекции. Определение факторов, влияющих на это взаимодействие может привести к более глубокому пониманию патогенеза заболевания и таким образом влиять на терапевтическую вакцину или дизайна. Таким образом, разработка методов для исследования этого взаимодействия было бы полезно. Последние достижения в области развития флуорофоров 1-3 и технологий визуализации 4 может быть использована для улучшения наших знаний о патогенезе лихорадки денге и тем самым проложить путь к снижению миллионов случаев инфекции денге, происходящих ежегодно.
Окутанный вирус денге внешние строительные леса, состоящие из 90 гликопротеина оболочки (E) димеров защиты нуклеокапсида оболочку, которая содержит единственный положительный цепь РНК геном 5. Идентичных субъединиц белка на поверхности вируса, таким образом, быть помечены амин реактивных красителей и визуализируются через иммунофлуоресцентного микроскопии. Здесь мы приводим простой способ маркировки вируса денге с Alexa Fluor сукцинимидил эфир красителя растворенные непосредственно в буфере бикарбонат натрия, который дал высокую жизнеспособных вирусов после маркировки. Существует нет стандартной процедуры для маркировки живого вируса и протокол существующих производителя по маркировке белка обычно требует восстановления красителя в диметилсульфоксид. Наличие диметилсульфоксида, даже в ничтожно малых количествах, могут блокировать продуктивной инфекции вируса, а также побудить ячейки цитотоксичность 6. Исключение использование диметилсульфоксида в этом протоколе сводится такую возможность. Alexa Fluor красители имеют более высокий фотостабильности и менее рН-чувствительной, чем общие красители, такие как флуоресцеина и родамина 2, что делает их идеальными для изучения клеточного поглощения и эндосом перевозки вируса. Сопряжение Alexa Fluor красителя не повлияло признание меченого вируса денге на вирус-специфических антител и его предполагаемым рецепторов в клетках хозяина 7. Этот метод может иметь полезные приложения в вирусологических исследований.
Protocol
Discussion
Хотя AF594 красителем была использована в данном докладе, широкий спектр флуорофоров в Alexa Fluor серии сукцинимидил эфиры можно получить с аналогичными химии маркировки. Это могло бы расширить применение маркировки за пределы изображения. Проточная цитометрия может быть использован как а?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансируется Национальным Советом по медицинским исследованиям, Сингапур.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- . . Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
