Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura
Summary
Approfittando dei progressi nello sviluppo fluoroforo e tecnologia di imaging, un metodo semplice di Alexa Fluor etichettatura dei virus dengue è stato ideato per visualizzare le prime interazioni tra virus e cellule.
Abstract
Gli eventi presto l'interazione tra virus e cellule possono avere un'influenza profonda sul risultato di infezione. Determinare i fattori che influenzano questa interazione potrebbe portare a una migliore comprensione della patogenesi della malattia e quindi influenzare vaccino terapeutico o di progettazione. Quindi, lo sviluppo di metodi per sondare questa interazione potrebbe essere utile. Più recenti progressi della fluorofori sviluppo 1-3 e tecnologia di imaging 4 può essere sfruttato per migliorare le nostre attuali conoscenze sulla patogenesi dengue e quindi aprire la strada per ridurre i milioni di dengue che si verificano ogni anno.
Il virus dengue ha un involucro esterno costituito da un'impalcatura di 90 busta glicoproteina (E) dimeri che proteggono il serbatoio nucleocapside, che contiene un singolo filamento positivo di RNA del genoma 5. Le subunità proteiche identiche sulla superficie del virus può quindi essere etichettato con un colorante reattivo ammina e visualizzati tramite microscopia a immunofluorescenza. Qui, presentiamo un semplice metodo di etichettatura dei virus della dengue con Alexa Fluor succinimidile estere colorante sciolto direttamente in un buffer di bicarbonato di sodio che ha dato virus altamente vitali dopo etichettatura. Non esiste una procedura standardizzata per l'etichettatura dei virus vivo e protocollo del produttore esistente per l'etichettatura delle proteine di solito richiede la ricostituzione di colorante in dimetilsolfossido. La presenza di dimetilsolfossido, anche in piccole quantità, in grado di bloccare l'infezione produttiva da virus e anche indurre citotossicità delle cellule 6. L'esclusione dell'uso di dimetilsolfossido in questo protocollo così ridotto questa possibilità. Alexa Fluor coloranti hanno fotostabilità superiore ed è meno sensibile al pH rispetto ai coloranti comuni, come la fluoresceina e rodamina 2, che li rende ideali per gli studi sulla captazione cellulare e il trasporto endosomali del virus. La coniugazione di Alexa Fluor colorante non ha influenzato il riconoscimento dei virus della dengue etichettati da virus-specifici anticorpi ed i suoi recettori putativi in cellule ospiti 7. Questo metodo potrebbe avere applicazioni utili in studi virologici.
Protocol
Discussion
Anche se AF594 colorante è stato utilizzato in questo rapporto, una vasta gamma di fluorofori nella serie Alexa Fluor succinimidile esteri è disponibile con la chimica etichettatura simili. Questo potrebbe estendere l'applicazione dell'etichettatura di là di imaging. Citometria a flusso può essere usato come alternativa alla microscopia confocale per valutare il grado di etichettatura per fluorofori che può essere eccitato e individuate dalla macchina FACS.
Alexa Fluor coloranti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Consiglio Nazionale delle Ricerche, Singapore.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
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