Procedure di Rat<em> In situ</em> Proprietà muscolatura scheletrica contrattili

1. Introduzione Il laboratorio MacIntosh ha utilizzato la preparazione muscolo gastrocnemio mediale per diversi anni, e prima ancora, il tutto preparato muscolo gastrocnemio, sviluppato con il Dr. Phil Gardiner 1. 2. Anestesia Adulti Sprague-Dawley (200-300 g) sono tipicamente utilizzati nel nostro laboratorio per lo studio delle proprietà contrattili in situ. Il ratto può essere vincolata in un dispositivo di plexiglass, disponibile in commercio, o rivestendo con un asciugamano, e tenendo. Usiamo ketamina / xilazina, (100 mg · ml -1, ciascuno) miscelati in 85:15, e somministrare 0,1 ml per 100 g di peso ratto intramuscolare 2,3. Sodio pentobarbital (50-60 mg · kg -1, intraperiteneal) o isoflurano (2-3,5%, inalazione) può anche essere usato 4. Mentre l'anestetico sta prendendo effetto, un peso preciso può essere ottenuto e sinistra arti posteriori rasata. Questo è anche un buon time per essere sicuri che tutta l'elettronica siano accesi e pronti. Questo include computer, calibro amplificatore ceppo, riscaldamento olio e altri. Controllare per il ritorno della risposta riflessa periodicamente e integrare l'anestesia, se necessario (da 0,05 a 0,1 ml per 100 g). 3. Avvio Chirurgia Usiamo una piattaforma sulla quale plexiglass per immobilizzare il ratto per la chirurgia. Nastro adesivo semplice fa il lavoro. Assicurarsi che l'animale è allungato da arti posteriori sinistra alla zampa anteriore destra. Aggiungere una goccia di lubrificante per gli occhi. Noi usiamo olio di paraffina. In caso contrario, gli occhi si asciuga con l'anestesia ketamina. Una piccola luce chirurgico è utile. Questo emette abbastanza calore per aiutare a mantenere l'animale caldo. In alternativa, una coperta riscaldamento dell'acqua può essere utilizzato. Verificare che i riflessi della cornea o del piede-pinch sono assenti prima di procedere. Tecnica sterile non è necessaria, perché questa procedura è acuta. L'animale non si riprenderà dall'anestesia. Abbiamo eutanasia il ratto con anesteticosovradosaggio (0,2 ml, intracardiaca) quando tutte le procedure sono state completate. La prima incisione è attraverso la pelle dal tallone alla colonna vertebrale. Usiamo forbici, poiché la profondità del taglio può essere controllata e le forbici sono utilizzati per separare la pelle dai tessuti sottostanti. I ratti hanno emostasi eccellente, così fino a quando si evita di grandi vasi sanguigni, sanguinamento sarà limitata. Tenere le superfici esposte ricoperte di soluzione salina isotonica garza imbevuta di, ove possibile. Dopo che la pelle è separato dal tessuto connettivo sottostante, lo strato muscolare superficiale viene tagliato. Fare attenzione a non andare troppo in profondità, non si vuole danneggiare il nervo sciatico o vasi sanguigni, o il muscolo di interesse. Ricominciare il muscolo gastrocnemio e tagliare prossimalmente, lungo la stessa linea della incisione cutanea. Sotto Peek per individuare ed evitare il nervo sciatico. Una volta che si vede il nervo, è possibile seguire il suo percorso con la tua incisione, ma rimanere ben al di sopra del nervo. C'è una cucitura chiara tra musCles. Individuare questo, e tagliare lungo che cucitura verso il ginocchio. Guarda per evitare e vasi sanguigni. 4. Preparare il foro pilota nel femore per perno osseo Tagliare il sottile strato di muscolo sulla faccia caudale del femore, esponendo l'osso nudo. Utilizzando uno strumento portatile rotativo, trapano, o viceversa pin, (0,9 mm in acciaio al carbonio fresa), fare un piccolo foro pilota attraverso la corteccia, e solo nel midollo. Non forare troppo in profondità, o sanguinamento eccessivo comporta. Questo foro verrà utilizzato successivamente per mettere un perno osso per immobilizzare il femore sulla base miografo. 5. Isolare innervazione del muscolo gastrocnemio mediale Il passo successivo richiede un microscopio da dissezione. Individuare il punto in cui il nervo popliteo scompare dietro il muscolo gastrocnemio mediale. Delicatamente sparsi vari rami, e tagliare tutto ciò che non si innervano il muscolo gastrocnemio mediale. Innervazione può essere determinato microstimolazione. A thifase s, anche assicurarsi che i rami superficiali del nervo sciatico sono tagliati. Ora annullare il tessuto connettivo dal nervo sciatico, in modo che possa essere infilato nel bracciale nervo (in seguito). Assicurarsi di trattare con delicatezza il nervo. Ogni tratto del nervo può portare a inexcitability, e alla fine l'esperimento prematuramente. 6. Isolare il tendine di Achille e del muscolo gastrocnemio Scollamento, con l'aiuto occasionale di forbici, può essere utilizzato per separare il muscolo gastrocnemio da altri tessuti. Il tendine del plantare può essere estratto da sotto il tendine di Achille, legato e tagliato. Il legame viene semplicemente usato per aiutare a mantenere il tendine e può essere tagliato via immediatamente dopo il tendine viene tagliato e il plantare è separato dal muscolo gastrocnemio per un lungo. Posizionare una legatura di seta # 1 in tutto il tendine di Achille, e cravatta in un nodo quadrato. Non tirare troppo stretto, o il tendine sarà danneggiato. Usiamo rongeurs osso per tagliare la calcan EUS, lasciando un piccolo pezzo di osso ancora attaccato al tendine di Achille. Tenere le superfici di taglio orizzontale per essere sicuri che l'osso viene tagliato, non solo il tendine. In questo modo il tendine di Achille può essere apposta sul miografo tardi. Lungo il lato inferiore del gastrocnemio, soleo può essere visto. Ancora una volta, smussa può essere utilizzata per separare il muscolo soleo dal muscolo gastrocnemio. Si desidera isolare i gastrocnemio mediale, quindi è l'unico muscolo ancora attaccato al tendine di Achille. Tagliare il tendine soleo, vicino all'estremità distale. Quindi è possibile separare i muscoli gastrocnemio mediale e laterale, e tagliare il tendine laterali, lasciando solo il muscolo gastrocnemio mediale attaccato al tendine di Achille. Tirare il muscolo gastrocnemio laterale dal mediale, lungo circa il 50% della sua lunghezza. Oltre questa lunghezza, le fibre si intersecano e danno risulterà dalla ulteriore trazione. Verificare che il muscolo è libero di tessuto connettivo. e "> 7. Tagliare la tibia Posizionare una legatura intorno al gambo, appena sopra il punto medio. Questo deve essere stretto, senza intaccare il tessuto. Un secondo ciclo prima legatura aiuta a prevenire lo scivolamento. Anche in questo caso utilizzare un nodo quadrato per fissare. Utilizzando un piccolo seghetto, tagliare la parte inferiore della gamba di distanza. Questo taglio dovrebbe essere di circa metà strada lungo la tibia. Inserire una sonda affilato nel midollo della tibia. Questa sonda viene usato per immobilizzare la tibia sulla base miografo. Collegare due elastici per la pelle, per mezzo delle clip Michel. Questi elastici e supplementare sarà utilizzato per tenere la pelle attorno al muscolo per formare un contenitore che sarà riempito con olio di paraffina riscaldata. [OPZIONALE] 8. Inserire cristalli sonometric (fase facoltativa) 5 Posizionare l'animale su un rilievo di riscaldamento al minimo. Una sonda rettale, se non è già inserito può essere inserito in questo momento. Utilizzare una piccola goccia di olio di paraffina per lubrificare. Utilizzando microstimolazione, identificare le estremità di un fascicolo all'interno del muscolo. Infilare un ago 21 gauge nel sito sia l'origine e inserzione del muscolo. Far scorrere un cristallo sonometric nel foro praticato dall'ago, e sigillare con vet-bond colla chirurgica. Utilizzare una goccia di colla, facendo attenzione che si trova proprio sopra il cristallo. Applicare la colla ad un pezzo di carta tagliata con un angolo acuto aiuta ad applicare la colla accuratamente. Stiamo ponendo un cristallo supplementare all'inserimento del fascicolo che è stato identificato da microstimolazione. [CONTINUA] 9. Montare in apparecchiatura (vedi figura 1) Posizionare il topo sulla base miografo, con la sonda tibiale orientata verso la leva. Posizionare la sonda nel supporto, per immobilizzare la gamba. Tirare la pelle fino ai lati, per formare un contenitore e fissare con elastici. Impostare punta (1/16 ° di pollice) nel femore, utilizzando il pilotabuco che è stato creato durante la preparazione chirurgica. Assicurarsi di sostenere il femore sulla parte anteriore, come si posiziona la punta (in una morsa pin) nella rottura di un femore può comportare, che chiude l'esperimento prematuramente. Fissare la morsa pin a una traversa di immobilizzare il femore. Posizionare il moncone distale del nervo sciatico con il bracciale nervo stimolante (catodo verso muscolare) e Tuck torna vicino all'origine del muscolo. Collegare lo stimolatore di questi fili. Collegare il tendine di Achille alla leva, che ha sensori estensimetrici su di esso. Tie snuggly, ma lasciare spazio per la regolazione successiva. Assicurarsi l'allineamento del muscolo è perpendicolare alla leva. Riempire il contenitore formato dalla pelle con olio di paraffina riscaldata. Accendere la lampada di calore e scudi in posizione di stagnola sulla testa dell'animale, ed il trasduttore di forza. Scudi fogli aggiuntivi possono essere necessarie per garantire la temperatura interna di un animale non exceed 38 ° C. La lunghezza del muscolo può essere regolata fino allentamento della stringa viene rimossa dal collegamento tra le gastrocnemio mediale e il trasduttore di forza. 10. Impostare la tensione massima e la lunghezza di riferimento Mentre il muscolo è in fase di riscaldamento, impostare lo stimolatore e verificare la tensione di stimolazione. È importante assicurarsi la stimolazione è fissato a durata di impulso molto breve. Usiamo 50 ms. Tensione massima deve essere inferiore a 1 V. A partire da 0,5 V, la tensione aumenta fino ampiezza twitch non aumenta. Tensione massima è il più basso di tensione che attiva tutte le unità motorie. Abbiamo tipicamente stimola al doppio della tensione massima, o 3 V se superiore. In genere, gli esperimenti inizierà con il muscolo alla lunghezza che dà la contrazione maggiore contrazione. Una contrazione è ottenuta con un singolo impulso stimolante. La lunghezza del muscolo è aumentata di circa 1 mm per un'altra contrazione. Questo viene ripetuto finché ampiezza twitchè in aumento. Una volta twitch ampiezza diminuisce, la lunghezza sarà restituito a quello che ha dato la scossa più grande ampiezza. A seguito di questa impostazione iniziale di lunghezza, ci prova il sistema con quello che noi chiamiamo una "contrazione tetanica di condizionamento". Lo stimolatore è impostato per fornire impulsi a 200 Hz per 500 ms. Consegna di questa stimolazione comporterà una contrazione tetanica completamente fusa. La forza generata dal muscolo serrare i collegamenti, compresi i nodi sul muscolo. Dopo un riposo adatto per la dissipazione del potenziamento 4, la lunghezza di riferimento del muscolo viene resettato (vedere parte 9.2). Di solito, la contrazione tetanica condizionata avrà permesso un po 'di accorciamento fascicolo lunghezza, in modo che il muscolo dovrà essere allungato un po' per tornare alla lunghezza che dà la più grande contrazione contrazione ampiezza. 11. Avviare l'esperimento Un esperimento tipico comprenderà regolaz lunghezzaent e / o stimolazione con una varietà di modelli di stimolazione. La raccolta dei dati può comportare solo la forza, o la forza, con la lunghezza, lunghezza fascicolo e elettromiografia. [OPZIONALE] 12. Forza-frequenza rapporto 2 Impostare la durata del treno abbastanza a lungo per raggiungere un plateau di forza a qualsiasi frequenza di interesse. La massima forza isometrica è raggiunto nel muscolo gastrocnemio mediale a 200 Hz. Durata treno deve essere di almeno 200 ms, è più meglio per basse frequenze, ma si tradurrà in qualche fatica se le contrazioni sono usate per determinare la gamma di forza-frequenza relazione. Usiamo tipicamente contrazioni a 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 200 Hz. Questa gamma di frequenze consentirà l'intera gamma di forza-frequenza rapporto da descrivere. Un riposo adeguato tra le contrazioni deve essere consentito di evitare l'affaticamento (1-10 min). 13. Force-lunghezza RAPPORTIIP 6 Con la lunghezza stimata ottimale stabilita in precedenza, una forza normale rapporto può essere determinato sistematicamente la regolazione della lunghezza del muscolo da mm -4 a +4 mm utilizzando un servomotore apparato. Questo dovrebbe essere fatto con la massima stimolazione (200 Hz), ma abbiamo trovato che le contrazioni molto brevi produrrà la stessa lunghezza reale ottimale 7. Contrazioni submassimali, come contrazioni, può essere utilizzato, ma questo produrrà una diversa lunghezza-dipendenza della forza 8. Un aspetto importante della determinazione della forza normale rapporto è la necessità di stimare la forza passiva alla lunghezza fascicolo in cui si verifica la forza misurata. Forza attiva viene calcolato come differenza tra la forza totale e la forza appropriata passiva. Poiché le strutture elastiche parallele sopportare la forza passiva e questi sono in serie con le strutture elastiche serie, il contributo alla forza passiva forza totale deve diminuire la serie elastrutture stic sono tese durante una contrazione 3. Una volta che la forza passiva è noto per tutte le lunghezze muscolari pertinenti, la forza appropriata passiva può essere stimata con misurazione continua della lunghezza fascicolo con sonomicrometry, o stimando la conformità del sistema di misura e le strutture in serie di muscolotendineo unità. Se questo non avviene, la lunghezza ottimale delle forze di preparazione e di picco, sono sottovalutati. 14. Forza-velocità rapporto 9 Se si desidera determinare la relazione forza-velocità, sarà necessario collegare i trasduttori di forza di un sistema, che consente di controllare sia carico o velocità di variazione di lunghezza. Il metodo più semplice e più conveniente è quello di utilizzare la pressione dell'aria per limitare accorciamento ad un carico controllato. Nel nostro sistema, il muscolo è collegato alla leva su un lato del fulcro e la pressione dell'aria impedisce cambiamento di lunghezza sul lato opposto. Un sensore lunghezza needs di essere impiegato in modo che siano in grado di rilevare la variazione di lunghezza del muscolo durante contrazioni isotoniche. Questa disposizione permette contrazioni afterLoaded con resistenza pneumatica. Due serbatoi può permettere contrazione isometrica con rilascio di un carico isotonica. Un totale di contrazioni 15-20 dovrebbe essere ottenuto, con carichi che vanno dal quasi vuoto per la massima forza isometrica. Durante il montaggio dei dati di un'equazione, carichi superiori al 90% del isometrica non deve essere utilizzato 9. 15. Rappresentante dei risultati: Contrazioni campione sono presentati nella figura 2. Queste contrazioni sono stati ottenuti per illustrare la relazione forza-frequenza. Calcolare la forza di picco attivo di tali contrazioni, e tracciando la forza attiva della frequenza, rese figura 3, la forza-frequenza relazione. I dati presentati in Figura 2 può essere adatta per l'equazione: AF = c / (1 + e ((AF) / b) + d); AF è forza attiva, F è la frequenza e, b, c, d sono costanti. Per il muscolo gastrocnemio mediale ratto, metà-massimale frequenza di stimolazione è tipicamente 50-60 Hz in non-muscolo affaticato 2. Risultati si adatta strettamente alla linea descritta dall'equazione sopra. Figura 1 Apparecchiatura e muscolo set-up:. Pneumatico set-up è mostrato a sinistra, a destra isometrica. Il sistema di leve mostrato sulla sinistra è attaccata alla tabella di conversione quando contrazioni dinamiche sono desiderate (adattato da 13). Il motore passo-passo è controllato da un computer (adattato da 14). . Figura 2 contrazioni isometriche sovrapposti: 20, 40, 60 Hz, 80, 100 e 200. L'ampiezza della contrazione 200 Hz è 8,13 N. les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg "/> . Figura 3 Force-frequenza relazione: la forza attiva di contrazioni in figura 2 sono tracciati e la linea rappresenta la linea di regressione.