Isolation und Charakterisierung von Hoechst ^Low CD45 ^Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

1. Lung Isolation Sacrifice erwachsenen Mäusen (8-10 Wochen im Alter; 18-20 g; C57Bl6J) Mäuse mit einer Überdosis Isofluran durch Ausbluten mit sterilen Technik gefolgt. Profile variiert leicht zwischen den Stämmen. Chirurgisch entfernen Sie die Membrane, öffnet den Brustraum durch Schneiden der Brustkorb seitlich auf jeder Seite der Maus. Spülen Sie das Blut aus der Lunge durch Perfusion der rechten Herzkammer vorsichtig mit 3-5mls von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Präparieren Sie die Lungenlappen Entfernen der Luftröhre und großen Bronchien und in eine Petrischale mit Hanks gefüllt Salzlösung (HBSS). Nach Sammlung aller Lungenlappen Pinzette verwendet, um Gewebe auf den Deckel der Schale statt. Das Gewebe wird dann in kleine Stücke mit Einweg-Skalpelle mit genügend Flüssigkeit, um sie feucht, aber nicht so sehr, dass sie und Schwimmer bewegen zerkleinert. Zerlegen einen Hinterlauf eines der Mäuse und zu isolieren, das Knochenmark als eine Färbung verwenden, um das flo gesetztw-Zytometrie Tore. Stain des Knochenmarks (BM), wie oben beschrieben 1. 2. Erstellung eines Single Cell Suspension aus Lungengewebe ; In sterile HBSS gelöst 5mls vorgewärmtes 0,2% Worthington Collagenase Typ 2 (cat # LS004202 Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ): Jede Lunge wird durch die Verwendung eines optimierten Gewebe Gewicht zu Volumen-Verhältnis von 0,2 g verdaut. Die Mischung wird in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min 2,3 getaucht. Man reibt Probe gut, bis Lungengewebe verdauen fließt leicht durch ein 10ml-Pipette (ca. 10 Wiederholungen). Inkubieren für weitere 15 min bei 37 ° C zur Vervollständigung der Gewebe verdaut und sorgt für eine gleichmäßigere einzigen Zellsuspension. Verdünnen Sie die Lunge Zellsuspension mit HBSS und verreiben mit einer 5ml Pipette, um restliches Gewebestücke zu zerstreuen. Filter die Suspension mit einer 70μM Zelle Sieb, um unverdaute Gewebestücke zu entfernen. Probe in Multipl aufgeteilt werdene konische Röhrchen an dieser Stelle auf eine Überlastung einer Zelle Sieb und die Zeit verringern. Pellet die Zellsuspension für 10 min bei 1500 rpm und Dekantieren des Überstandes. Resuspendieren Zellpellet vorsichtig mit Raumtemperatur RBC Lysispuffer (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) und inkubieren bei RT 5 min. Fügen Sie ein gleiches Volumen an HBSS dem Lysepuffer inaktiviert und Filtern der Zellsuspension mit einer 40 um Zellsieb zu Schutt und Zellaggregate zu entfernen. Pipette 10 &mgr; l jeder Probe werden gefärbt und zählen Zellzahlen sowohl für die Lungen-und BM-Proben mit einer Zählkammer. Hinweis: Notieren Sie sich die Gesamtmenge der Zellen. Pellet die einzigen Zellsuspension von Lungenzellen durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 10 min. Resuspendieren beide Lungen-und BM-Zellen bei 1×10 6 Zellen / ml in vorgewärmten (37 ° C) DMEM + (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit hoher Glukose (Gibco, Carlsbad, CA, cat # 11965-092) mit 2% fetalem bovine Serum (FBS) und 10mm HEPES. Bereiten Sie eine 1mg/ml Stammlösung von Hoechst 33342 Farbstoff (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; cat # B2261) in Wasser und Filter sterilisieren 1,4. Die Hoechst-Farbstoff kann als Aliquots bei -80 ° C gelagert werden Add Hoescht 33342 Farbstoff zu einer Endkonzentration von 5μg/ml (a 200x Verdünnung einer 1mg/ml stock) zu den einzelnen Zell-Suspension. Mischen Sie die Zellen durch vorsichtiges Inversion und inkubieren in 37 ° C Wasserbad für genau 90 Minuten. 3. Färbung und Vorbereitung der Lung Zellsuspension für Durchflusszytometrie Nach 90 min alle Schritte mit Hoechst gefärbt Lungenzellen muss bei 4 ausgeführt werden ° C oder auf Eis zu färben Efflux zu verhindern. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 10 min bei 4 ° C, und Zellen in eiskaltem Färbepuffer (PBS +2% FBS). Die Zellen in einer Konzentration von nicht mehr als 1×10 7 Zellen / Tube mit 300-600μl PBS mit 2S und 10 mM HEPES. Ausreichend kicherten hinzufügen CD45-Antikörper (typischerweise 1:200 Verdünnung des CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; cat # 559864), um die Lungen-und BM-Proben auf Eis inkubieren für 10-15 min Inklusive ungefärbten Kontrolle während der.. experimentelle Vorgehensweise ist sinnvoll, die Analyse Toren gesetzt. Pellet-Zellen bei 4 ° C für 5 min bei 1500 Umdrehungen pro Minute. Dekantieren Sie den Überstand und die Zellen in 500 ul von gekühlten Färbepuffer (PBS +2% FBS). Transfer zum vorgekühlten Schnappdeckel Polypropylenröhrchen (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). Add Propidiumiodid (PI, 200μg/ml Lager in PBS), um die Proben für eine Endkonzentration von 2μg/ml um tote Zellen auszuschließen. PI muss in Kombination mit dem Hoechst 33342 Farbstoff auf die richtige Fluoreszenz-Profil auf die durchflusszytometrische Analyse zu erreichen verwendet werden. Shop Röhrchen auf Eis, von leichten bis Durchflusszytometrie geschützt. 4. Durchflusszytometrie-Analyse zu definieren und zu isoliereneine Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge) Bevölkerung mit Hoechst-Farbstoff Efflux zu einem Side Population (SP) Detect Dieser Test hat folgende gerätespezifische Anforderungen: 488 nm und UV (350-355 nm) Laser 2 Detektoren auf dem UV-Laser-Pfad mit blauen (450/65) und rot (675/50) Filter. Die UV-Infrarot-Detektor müssen eine hohe Sensibilität für das rote Signal. Dies kann ein Problem mit älteren Zellsortern werden. Chiller-Einheit, um die Probe bei 5-10 ° C zu halten Richten Laser und eingerichtet für Zellsortierung nach dem Protokoll des Herstellers. Sammeln Sie die rote (x-Achse) und Blau (y-Achse) Hoechst-Signale mit einer linearen Skala. Passen Sie die Photomultiplier Spannungen an die G0/G1 Gipfel in der oberen rechten Ecke des Zentrums Platz auf dem Grundstück für eine angemessene Darstellung von der hinteren Seite der Bevölkerung zu ermöglichen. Ein Teil der S-Phase und die gesamte G2 des Zellzyklus kann off-Skala auf der rechten oberen Ecke des Grundstückes. Die blaue signal ist relativ hell, während das rote Signal ist schwach. Typische MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) Spannungen sind 425 für den blauen und 650 für den red. Tote Zellen werden gated unter Verwendung von PI. Die Standard-PI-Pfad (Anregung 488nm, Emission 630nm) verwendet werden kann. Alternativ ist PI auch durch die UV-Laser angeregt und die Toten Zellpopulation liegt außerhalb des Messbereichs auf der rechten Seite der Side Population (SP) Plot. Somit entfällt die Notwendigkeit, die PI-Signal von einem anderen Fluorochromen wie FITC und PE zu kompensieren. Die ursprüngliche Goodell Methode folgte dem letzteren Verfahren 5-7. Achten Sie auf eine relativ geringe Druckdifferenz während der Analyse und Sortierung der engen Auflösung der Side Population zu gewährleisten. Die SP wird als Seitenarm abseits der großen Population von Lungenzellen. Diese Bevölkerung wird als Hoechst gering. Die Hoechst low / SP wird analysiert, um die CD45 positiven und negativen Populationen mit Hilfe eines Histogramms 2,3 (F separatenBBILDUNG 1). Nach Auswahl und Verknüpfung der Hoechst niedrigen CD45 neg Lunge MSC Bevölkerung können die Zellen durch die Sortierung entweder als eine gemischte Bevölkerung in einem Rohr oder einzelne Zellen, um Klone in eine 96-Well-Platte 3 zu isolieren gesammelt werden. Für Teller Sortierung der Art stream Ablenkung ist auf 25% eingestellt, um eine vertikale Art stream als die in der Regel für Rohr Sortierung verwendet erstellen. Richten Sie die Art stream, indem ein Test-Stream-Puls auf die obere linke und dann die rechte untere Vertiefung einer 96-Well-Platte. Setzen Sie den Sorter Software Platte Karte, um die gewünschte Anzahl von Zellen in jedes Well hinterlegen. Zur Isolierung einzelner Zellklone eine einzige Lunge MSC wird in die Vertiefung einer 96-Well-Platte in 150 &mgr; l von Kulturmedien (α-MEM mit 20% FBS) sortiert. Nach der Art einer zusätzlichen 100 &mgr; des Mediums zugegeben. 5. Isolation, Kultur und Charakterisierung von Lungen-MSC und Clones Culture und den Ausbau von gemischten Lunge MSC Bevölkerung und einzelne Zellklone folgende Sortierung ist identisch mit Standard-Kulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 und> 95% Luftfeuchtigkeit). Die Zellen sind erlaubt, nach der Isolierung für 16 Stunden einzuhalten. Media ist alle 48 Stunden ersetzt (α-MEM mit 20% FBS). Wenn die Zellen beginnen sich schneller zu vermehren und zu erreichen zwischen 75-80% Konfluenz passagiert werden (Abbildung 2). Die Zellen werden mit vorgewärmtem HBSS gespült und mit 0,5% Trypsin / EDTA (CellGro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) bei 37 ° C für weniger als 2 min. Cells werden anhand einer invertierten Rahmen, um das Erscheinungsbild einer Zellsuspension zu bestätigen. Lung MSC werden dann in Verhältnissen von 1:2 oder 1:3 je nach der aktuellen Proliferationsrate der Kultur unterteilt. Die Fähigkeit der Lunge MSC in traditionellen mesenchymale Linien der Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten und ihrer Zelloberfläche Ausdruck akzeptiert mesenchymalen Markern differenzieren is für jede Zelle Vorbereitung ausgewertet. Zytogenetische Bandenanalyse wird auch durchgeführt, um das Fehlen grober Chromosomenanomalien 2,3,8-11 bestätigen. 6. Enumeration der Lunge MSC mit einem Colony Forming Assay (CFU-F) Verdünnen Zellen in komplette MesenCult Medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) bis zu einer Endkonzentration von 1×10 6 Zellen / ml. Führen Verdünnungsreihen auf Endkonzentrationen in einem 100mm Teller 6×10 4 Zellen, 3×10 4 Zellen, 1,5 x10 4 Zellen und 0,75 x10 4 Zellen in 10 ml Medium zu erreichen. Die Analysen werden in doppelte oder dreifache für jede Zelle Konzentration durchgeführt und kann bei kleineren Flächen skaliert werden. Kultur-Zellen für 10 Tage unter Standardbedingungen. Am Tag 10 Zellen werden mit PBS gespült und fixiert mit 100% Methanol für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Ermitteln Sie die CFU-F Kolonien durch Färbung mit 0,4% w / v Giemsa-Färbelösung(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) 1:20 verdünnt mit destilliertem Wasser. Werden die Proben an der Luft trocknen und zu quantifizieren, die Anzahl der Kolonien mit mehr als 25 Zellen pro Kolonie (Abbildung 3). 7. Die Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften von Lungen-MSC auf T-Zell-Proliferation und Apoptose 6.25×10 4 Lunge MSC-Zellen pro Well in 96-well-Platten ausplattiert und über Nacht 2 stehen. CD4 +-Zellen aus der Milz von T-Zell-Rezeptor (TCR) transgenen Mäusen, OT-II mit T-Zellen, die Ovalbumin 323-339 Peptid erkennt, werden durch abbauende CD8 +, CD19 +, MHC-II + und CD25 +-Zellen mit gereinigtem ein Miltenyi AutoMACS Zellsortierer (Miltenyi, Auburn, CA). Antigen-präsentierenden Zellen (APC) werden durch positiv Sortierung MHC-II + Zellen 12 isoliert. APC sind in 4% Paraformaldehyd fixiert, gewaschen 3 mal in PBS / 5% BSA/2mM EDTA, und beladen mit 0.5μg/ml oder 5μg / ml OVA323 Peptid. Simulierte, Wachstum verhaftet APC sind in die Lunge MSC in 96-Well-Platten gegeben. Mehr als 95% reinen CD4 + 1×10 5 Zellen werden mit 5 &mgr; M Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE, Sigma, St.Louis MO) bezeichnet in PBS und inkubiert für 5 min im Dunkeln, mit PBS gewaschen-5% BSA, und dann zu den zusätzlichen APC und Lunge MSC-Zellen in DMEM 5% FBS Medien. Die Zellen werden dann für 96 Stunden inkubiert. CD4 (APC-Cy7);; CD8 (ViolBlue); T-Zellen werden dann mit anti anti-CD40 (Cy5) angefärbt Vbeta 5 (PE) und untersucht mit Hilfe eines Miltenyi MacsQuant 7-Kanal-Durchflußzytometer (Miltenyi, Aurburn, CA) und Flojo Analyse-Software (Treestar, Ashland, OR). Proliferation als die Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität von CFSE im Vergleich zum Hintergrund gemessen, T-Zellen mit CFSE markiert und nicht zu APC ausgesetzt (Abb. 4). T-Zellen sind in dieser Zeit und die Lebensfähigkeit mit Trypanblau-Ausschluss beurteilt gezählt. 8. Repräsentative Ergebnisse: <p class="Jove_content"> Abbildung 1. Durchflusszytometrische Analyse und Definition von Lung MSC. Einzel-Zell-Suspensionen von Lungengewebe zu verdauen sind mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um Unterschiede in A zu erkennen. forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC) und B. Hoechst blaue und rote Fluoreszenz. Die Anwesenheit eines Side Population (SP) ist sichtbar in das Tor. Die Hoechst niedrige SP wird dann analysiert, um die C trennen. CD45 negativen Bevölkerung von Lungen-MSC. Die CD45-positiven zu negativen Kennzahlen der Lungenfunktion SP sind in der Regel 70:30 / 60:40. Abbildung 2. Isolierung und Kultivierung von Lung MSC. Nach dem Sammeln der Lunge MSC durch Zellsortierung werden die Zellen in 30mm Gerichte mit α-MEM Nachtr. vernickelttierte mit 20% FBS. A. Frisch sortierten Zellen erscheinen klein, rund und leuchtend. B. Nach etwa 2-3 Wochen Kolonien mit einem mesenchymalen Phänotyp deutlich geworden und Proliferation ist offensichtlich. Abbildung 3. Auszählung von MSC durch Colony Forming-Fibroblast-Assay. Expanded Lunge MSC sind gemäß dem beschriebenen Protokoll für die CFU-F-Assay vernickelt. A. Nach 10 Tagen und Giemsa-Färbung Kolonien sind evident. B. Kolonien sind groß und aus einem Einige hundert Zellen. C. Die Zellen zeigen eine mesenchymalen Phänotyp. A & B, Maßstab = 0,5 cm; C Skala bar = 0,14 cm. Abbildung 4. CFSE Based T-Zell-Proliferation Assay. In Abwesenheit von Lungen-MSC und Gegenwart antigen-präsentierenden Zellen (APC) + / – Ovalbumin (OVA) CD40 positive Effektor-T-Zellen zeigen eine Abnahme der CFSE-Intensität, welche die Proliferation zeigt (roter Kreis). CFSE Fluoreszenz-Intensität des T-Zell-Membran verringert stöchiometrisch mit jeder Zellteilung, dh. mit jeder Sparte. In Anwesenheit von Lungen-MSC, APC + / – OVA zeigen CD40 positive Effektor-T-Zellen keine signifikante Veränderung in CFSE Intensität, die einen Mangel an Verbreitung zeigt (roter Kreis).