Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium

1. PCR Şablon Hazırlama Not:) 1) şablonu (DNA) hazırlanması, 2 PCR kurulumu, ve 3) jel elektroforezi: PCR kontaminasyon en aza indirmek için, birçok önemli önemli adımlar PCR birbirlerinden fiziksel-ayrı tutmak için önemlidir. Ayrıca pipetters kültür veya reaktif kontaminasyonu önlemek için bariyer ipuçları kullanılması tavsiye edilir. Tek bir izole koloni izole Salmonella Luria Bertani et suyu ya da diğer karmaşık orta (Beyin Kalp İnfüzyon, Superbroth, vb.) 1 ml inoküle edin . Gecede kültür inkübe 37 ° ° C. 1 ml steril, 1.5 ml kapasiteli mikrofuge'de tüp aktarın, yaklaşık 2 dakika süreyle 4500 xg'de bakteriyel hücre süspansiyonu santrifüj. pelet hücreleri. Durusu süpernatant, oda sıcaklığında 10 dakika süreyle% 100 etanol ve set 1 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Pelet (4,500 xg, 2 dak.) Daha önce olduğu gibi hücreleri, 1 ml PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak. Santrifüj hücreleri (4,500 xg, 2 dak.), 1 ml steril dH 2 O supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri silmek -20 DH 2 O (5 μl/95 ul dH 2 O) ve mağaza ° C nihai hücre süspansiyonu 1 / 20 sulandırınız PCR şablon olarak tüm hücreleri -20 ° C'de raf ömrü yaklaşık bir ay. 2. PCR Kurulum Not: PCR reaksiyon karışımı (şablonu tamponlar, oligonucletoideprimers, nükleotidler ve Taq DNA polimeraz) hazırlanması ve dağıtımı, PCR UV / iş istasyonu adanmış ve tercihen yapılan fiziksel olarak ayrı bir odada yapılması gerekir. Not: PCR oda da PCR kurulum, tek kullanımlık lateks eldiven için adanmış pipetter atanmış bir -20 ° C PCR depolama için dondurucu (tamponlar, oligonükleotid primerler ve nükleotidlerin), enzimler ve şablon ile kendine yer almalıdır kurdu , laboratuvar ceket, bariyer ipuçları, microtiter plakalar, cam kapilerleri, mikrofuge'de tüpler, ve dekontaminasyon yüzeyler için% 10 çamaşır suyu. PCR dağıtmak için özel bir pipetter seti (P10, P100, P1000) kullanın. Bu pipet seti set-up istasyonu asla terk gerekir. Not: moleküler biyoloji ya da PCR derece dH 2 O ve kısım 1 ml 1.5 ml kapasiteli santrifüj tüplerine alın. Çapraz bulaşmayı önlemek için her kullanımdan sonra aliquoted dH 2 O koyun. Benzer bir yaklaşım, diğer PCR ile tavsiye edilir. Not: UV aydınlatma ve / veya% 10'luk çamaşır suyu ile yüzey aşağı silme kullanmadan önce çalışma alanı dekontamine. PCR kurulum yapmadan laboratuvar ceket ve lateks eldiven giyin. PCR ile ileri ve geri trafiğini azaltmak PCR reaksiyonları thermocylcer ve PCR ürünleri agaroz jel (amplikonlarının) ayrılır inkübe alanlarda set-up. PCR set-up alana geri giderseniz, henüz giyen ve yeni bir çift eldiven, lateks eldiven çifti atmayın. 5×10 -4 M. bir konsantrasyon dH 2 o ana astar stok olun 1 / 20 dH 2 O (25 mcM 5 μl/95 ul dH 2 o) primerler seyreltilir. Her flagellin yazarak astar oligonükleotid sırası Tablo 1'de açıklanmıştır. -20 ° C derin dondurucu PCR ve şablon almak ve reaktifler ve numune buz üzerinde çözünme izin. Taq DNA polimeraz gerektiği kadar dondurucuda bekletin. Allelotyping PCR reaksiyon karışımı Tablo 1'de açıklandığı gibi reaktifler koyun. Sütun (örneğin, A1) üst kısmında başlayan ve sonraki üst sütunu aşağı hareket, steril, 96-de, polistiren mikrotiter plate 10 yuvarlak alt kuyuların her birine PCR reaksiyon karışımı 9μl dağıtın. Pozitif kontrol şablonları (0.5μl ilk kuyusu (A1), (DNA kontrolü) PCR karışımı 9 ul 1 dH 2 O ul Ekle i / g, m yazarak primerleri Typhimurium ve Enteritidis; r/z10 yazarak primerleri-Heidelberg ve Hadar ve 1,2 / e, n, x yazarak primerleri-Typhimurium ve Hadar) 9 ul 2. PCR karışımı (B1) ve 1 ul Escherichia coli K12, DH5α üçüncü kuyuda PCR karışımı 9 ml (C1). Her ek iyi (D1-H1, A2, B2), PCR reaksiyon karışımı 9 ul 1 ul çözülmüş örnek şablonu ekleyin. I / g, m allelotyping PCR, S. için enterica serovar Typhimurium (i) ve Enteritidis (g, m) pozitif kontrol olarak hizmet ve Salmonella serovars Heidelberg (r) ve Hadar (z10) r / z 10 allelotyping multipleks PCR için pozitif kontrol. 10 ul kapasitesi cam kapilerleri Idaho Teknoloji Rapidcycler (8) için belirlenmiş sahipleri içine yerleştirin. bir kez sahibinin güvenli, her bir cam kapiller dokunarak PCR reaksiyon karışımı ile kapiller yükmikrotiter plate alt kuyu. Sıvı tüp aşağı hareket ve ısı, kılcal damarların her iki ucunda mühür için bir bütan meşale ile cam tüp sızdırmazlık önce sona erer ve PCR karışımı arasında boşluk sağlamak için izin sahibinin yatırın. Kılcal tüpler ve tutucu Idaho Teknoloji Rapidcycler içine yerleştirin ve PCR çalışması için farklı allelotyping primerler Tablo 1'de açıklanan PCR programları kullanın. PCR programı tamamlandıktan sonra jel elektroforezi adıma geçin. 3. Jel Elektroforez Not: elektroforez laboratuvar kullanımı için belirlenmiş farklı bir laboratuvar önlüğü ve yeni bir çift tek kullanımlık lateks eldiven giyin . Not: UV koruyucu göz gözlük veya yüz siperi giyin ve her zaman etidyum bromür, özellikle agaroz jel ele eldiven vardı. 100 ml% 1.5 (w / v) 1xTAE moleküler biyoloji sınıf agaroz elektroforez tamponu (7) art arda 2-5 dakika aralıklarla% 20 güç periyodik görsel bir mikrodalga agaroz süspansiyon ısıtma (veya 1X TBE) erimiş hazırlayın muayene. Erimiş agaroz 60 ° C su banyosu su banyosu sıcaklığı equilibrates kadar ayarlayın. Jel kalıp erimiş agaroz dökülmeden önce tarak ile ayarlayın. Denetimleri, örnekler ve biter ve agaroz jel ortasında yerleşimler için en az 3 molekül ağırlığı standartları için yeterli kuyuları üretmek için yeterli dişlere sahip bir jel tarak seçin. Ul 2 ethidium bromür (10 mg / ml) 100 ml erimiş% 1.5 (w / v) 1xTAE agaroz (TBE), karışımı yavaşça girdap şişe üreten kabarcıkları önlemek için, şişe içeriği ve yavaşça dökün 10 cm agaroz jel için 15 jel kalıp ortasına. Agaroz jel kabarcıkları kağıt mendil ya da kağıt havlu kenarı kullanın. Agaroz katılaşır (~ 30-45 dk) kadar oda sıcaklığında jel kalıp edelim. Dalgıç, yatay elektroforez odasına 1X TAE (veya 1X TBE) elektroforez tamponu içeren jel ve tarak ile jel tepsisi aktarın. Agaroz jel tarak yavaşça çıkarın. Bu kutup jel altındaki emin olmak için elektroforez odasının katot veya pozitif kutup göre jel tepsisi yerleştirme kontrol edin. Not: katot doğru negatif yüklü DNA göç (yani, "kırmızı çalıştırmak") unutmayın. 6X DNA Yükleniyor Boya 40 ul DNA molekül ağırlığı belirteçleri (0.25 mcg / ml) karışımlar 200 ul. İlk, orta ve son kuyuların önceden karıştırılmış DNA Molekül Ağırlığı Marker XIV 4.8 ul yükleyin. PCR örneklerinin her biri de 2 ile başlayan ve sonraki her iyi ilerleyen, soldan sağa hareket yükleyin. Herhangi bir moleküler ağırlık standardı içeren kuyulardan numune yükleme kaçının. Her cam kapiller bulunan örnekler yüklemek için: Tutucu ve kılcal bir cam kesici ile aşındırma sona erer her kılcal çıkarın. Place başparmak ve işaret parmağı ile her iki ellerini cam kesici ile işaretlenmiş kılcal her iki tarafında ve kılcal ek bileşenini. PCR reaksiyon karışımı sonunda tam tersi kılcal dağıtıcı yerleştirin ve yavaş yavaş sıvı tüpün en alt gelene kadar pistonu saat yönünde çevirin. Kapiller yüklenecek kuyunun içine yerleştirin ve yavaş yavaş iyi agaroz Ficoll ağırlıklı numune dağıtmak için pistonu saat yönünde çevirin. Ponksiyon iyi sıvı son kılcal ayrıldığında çok geçmiş dönüm kılcal ya da iyi bir hava kabarcığı tanıtmak için dikkatli olun. Bir kez tüm numuneler ve standartlar yüklenir, V (9 volt / cm agaroz jel) 90 sabit gerilim güç kaynağı. Sarı boya (Taurazine) ön kez elektroforez jel alttan 1 cm bırakın. Elektroforez tamamlandıktan sonra, DNA parçaları ve molekül ağırlığı standart görselleştirmek için jel UV transilluminator'de aktarın. Polaroid filmi ya da bir termal yazıcı ile bir CCD kamera ve baskı görüntüsü kullanarak dijital görüntü olarak: turuncu cam filtre (2 x ve 4,5 y ayarları) ile bir Polaroid kamera kullanarak görüntü yakalayın. 15-30 dakika süreyle% 10'luk çamaşır suyu kılcal sahipleri yerleştirin. DH 2 O ve PCR kurulum oda hava kuru yerde 3 kez durulayın. 4. Temsilcisi Multiplex PCR Sonuçlar Salmonella allelotyping PCR Sonuçlar 1-10 Şekil 1 (3-12 şeritli) gösterilen ve aşağıdaki gibi yorumlanır izole eder. O allel atama PCR kontrolü boyutunda eşleşen Amplikon (PCR ürünü) dayalı izole Salmonella verilen ve O aleli astar olarak tahmin edilmektedir (3) ayarlar: B-560bp, C1-340bp, C2-400 bp D1-620 bp, E1-280 bp. O allel B (10 şeritli atanan O allelotyping PCR (Şekil 1A), test izolatlarının içinOn Salmonella 13), C1 (7-9 şeritli), C2 (şerit 4, 5), D1 (şerit 3), ve E1 (6 şeritli), şerit 3-12 test izole eder . Bu aynı Salmonella izolatları Şekil olarak aynı sırayla test edildi. 1A, H1 allel i; g, m, r ve z10 (Şekil 1B, C). (3) Yine, H1 allel her PCR kontrolü boyutu ile eşleşen bir Amplikon varlığına bağlı izole atanır ve 4 H1 allel astar için öngörülen ayarlar: i-510 bp (Şekil 1B, 2 şeritli ); g, m-310 bp (Şekil 1B, şerit 2), r-170 bp (Şekil 1C, şerit 2) ve z10-360 bp (Şekil 1C, şerit 2). H1 allel on Salmonella izolatlarının ayrıldı: i – 3 ve 8 (Şekil 1B, 5 ve 10 şeritli) izole, g, m-izolatları 1 ve 5 (Şekil 1B, 3 ve 7 şeritli), r izolatları 6 ve 9 (Şekil 1C, şerit 8 ve 11);. izolatları 2, 7 ve 10 (Şekil 1C, şerit, 4, 9, ve 12) ve z10 Salmonella izole 4 test edilen dört H1 allel için negatif idi . Son olarak, Salmonella izolatları 1,2 ile ilişkili H2 allelleri için PCR ile test edilmiştir, 1,5, 1,6, 1,7 antijen kompleksi ve e, n, x, e, n, Z15 antijen kompleksi. H2 1,2 astar ayarlar; 1,5, 1,6, 1,7 karmaşık ve H2 e, n, x, e, n, Z15 karmaşık 290 bp ve 150 bp amplikonlarının, (3). Primer setleri, kesin bir allel tipi, eski atamak için karmaşık ya H2 antijen içinde belirli H2 allel ayrım yapamaz. 1,2, (3) Salmonella izole izole 4, 6, 8-10 H2 1,2 ile ilişkili H2 allelleri için pozitif, 1,5, 1,6, 1,7 antijen kompleksi izolatları 2 ve 7 e, n, x ile ilişkili H2 allelleri için olumlu; e, n, Z15 antijen kompleksi (veriler gösterilmemiştir). Salmonella, 1, 3, ve 5 iki H2 antijen kompleksleri için negatif idi izole ederken, sadece 1 ve 5, H2 flagellin için genel bir H2 flagellin PCR (1) (veri gösterilmez) kullanılarak belirlenir negatifti izole . Bu sonuçlar her izole etmek için atanan olası Salmonella serovar ile birlikte Tablo 2'de özetlenmiştir. Şekil 1. S. ile İlişkili Özgül O ve H Alleller belirlenmesi için Multiplex PCR enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, ve Typhimurium (A) O Allel Multiplex PCR. (B, C) Flagellin Alleller belirlenmesi için H1 Allel Multiplex PCR: i / g, m (B) ve r/z10 (C). Lanes: 100 baz puan (bp) merdiven (Promega; Madison, WI); şeritli 2: O allelleri için multipleks PCR kontrolleri, B, C1, C2, D1, ve E (A), H1 allel 1 ve 13 / g, m (B) ve 1-10 (Tablo 2) H1 allel r/z10 (C) ve şerit 3-12: Salmonella izole eder. PCR Master Mix PCR (Rapidcycler) Reaktifler Kompozisyonu / konsantrasyon Miktar   Parametreler Beklenen Boyutu H1 i / g, m dH 2 O 63 ul Program 1 1 dakika için 94 ° C 10X PCR buffer 20 mM MgCl 2 10 ul Program 2 1 s için 94 ° C 500 mMTris pH8 1 s için 55 ° C 2.5 mg / ml BSA 20 saniye 72 ° C % 5 Ficoll 400 40 devir için 10 mMTartrazine Eğim = 2.0 Primer i (f) * AACGAAATCAACAACAACCTGC 2 ul Program 3 4 dakika süreyle 72 ° C 510 bp Primer i (r) * TAGCCATCTTTACCAGTTCCC 2 ul Primer g, m (f) * GCAGCAGCACCGGATAAAG 2 ul 310 bp Primer g, m (r) * CATTAACATCCGTCGCGCTAG 2 ul DMSO 5 ul dNTP 10 mM 2 ul Taq 5 adet / ml 2 ul 90 ul H1 r / z 10 dH 2 O 55 ul Program 1 1 dakika için 94 ° C 10X PCR buffer 30 mM MgCl 2 10 ul Program 2 1 s için 94 ° C 500 mMTris pH8 1 s için 55 ° C 2.5 mg / ml BSA 20 saniye 72 ° C % 5 Ficoll 400 40 devir için 10 mMTartrazine Eğim = 2.0 Primer r (f) * CCTGCTATTACTGGTGATC 4μl Program 3 4 dakika süreyle 72 ° C 170 bp Primer r (r) * GTTGAAGGGAAGCCAGCAG 4μl Primer z 10 (f) * GCACTGGCGTTACTCAATCTC 4μl 360 bp Primer z 10 (r) * GCATCAGCAATACCACTCGC 4μl DMSO 5 ul dNTP 10 mM 2 ul Taq 5 adet / ml 2 ul 90 ul PCR Master Mix PCR (Rapidcycler) Reaktifler Kompozisyonu / konsantrasyon Miktar   Parametreler Beklenen Boyutu H2 1,2 / e, n, x dH 2 O 63.6 ul Program 1 1 dakika için 94 ° C 10X PCR buffer 20 mM MgCl 2 10 ul Program 2 1 s için 94 ° C 500 mMTris pH8 1 s için 55 ° C 2.5 mg / ml BSA 20 saniye 72 ° C % 5 Ficoll 400 40 devir için 10 mMTartrazine Eğim = 2.0 Primer 1,2 (f) * AGAAAGCGTATGATGTGAAA 2 ul Program 3 4 dakika süreyle 72 ° C 290 bp Primer 1,2 (r) * ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC 2 ul Primer e, n, x (f) * TAACTGGCGATACATTGACTG 2 ul 150 bp Primer e, n, x (r) 1 TAGCACCGAATGATACAGCC 2 ul DMSO 5 ul dNTP 10 mM 2 ul Taq 5 adet / ml 2 ul 90 ul Jenerik H2 dH 2 O 72 ul Program 1 1 dakika için 94 ° C 10X PCR buffer 30 mM MgCl 2 10 ul Program 2 10 s için 94 ° C 500 mMTris pH8 10 s için 45 ° C 2.5 mg / ml BSA 35 s için 72 ° C % 5 Ficoll 400 40 devir için 10 mMTartrazine Eğim = 2.0 Primer fljB (f) * CAAGTAATCAACACTAACAGTC 2 ul Program 3 4 dakika süreyle 72 ° C 1.500 bp Primer fljB (r) * TTAACGTAACAGAGACAGCAC 2 ul dNTP 10 mM 2 ul Taq 5 adet / ml 2 ul 90 ul Tablo 1. Salmonella flagellinallelotyping PCR için Protokol: kompozisyon, koşullar ve beklenen sonuçlar. * PCR oligonükleotid primerler çalışma stok konsantrasyonu 25 mcM Izole etmek O Allel H1 Allel H2 Allel Serovar   B C1 C2 D1 E ben g, m r z10 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e, n, x, e, n, Z15 Jenerik 1   1 – – – + – – + – – – – – Enteritidis 2 – – + – – – – – + – + + Hadar / İstanbul 3 3 – – + – – + – – – – – + Kentucky 4 – – – – + – – – – + – + Bilinmeyen 5 – + – – – – + – – – – – Montevideo 6 – + – – – – – + – + – + Infantis veya Virchow 2 7 – + – – – – – – + – + + Mbandaka 8 + – – – – + – – – + – + Typhimurium 9 + – – – – – – + – + – </td> + Heidelberg 10 + – – – – – – – + + – + Haifa Tablo 2. O, H1, H2 Alleller Kimlik dayanarak Allelotyping PCR (Şekil 1) ve Salmonella serovar belirlenmesi > 1 H2 PCR H2 alleli (1) ne olursa olsun, H2, flagellin sahip tüm Salmonella 1.5 kb Amplikon üretir. Bu PCR monofazik bifazik Salmonella ayırt etmek için kullanılır. 1,5, 1,6, 1,7 antijen kompleksi (3) 2 H2 multipleks PCR H2 1,2 için farklı alleller arasında ayrım olamaz. S. 3 Faj dönüşüm serovar İstanbul üretmek için enterica serovar Hadar değiştirir LPS O antijeni. O allelotyping PCR bu ince genetik / antijenik değişiklikler ayırt edemez. Serovar 1 O Allel H1 Allel H2 Allel   B C1 C2 D1 E ben g, m r z10 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e, n, x, e, n, Z15 Jenerik 2 Kaliforniya + – – – – – + – – – – – Typhimurium + – – – – + – – – + – + Heidelberg + – – – – – – + – + – + Haifa + – – – – – – – + + – + Montevideo – + – – – – + – – + – + Othmarschen – + – – – – + – – – – – Athinai – + – – – + – – – – + + Papuana – + – – – – – + – – + + Mbandaka – + – – – – – – + – + + Chincol – – + – – – + – – – + + Kentucky – – + – – + – – – – – + Hadar / İstanbul 3 – – + – – – – – + – + + Enteritidis – – – + – – + – – – – – Seremban – – – + – + – – – + – + Campinense – – – + – – – + – – + + Lome – – – + – – – + – – – + Portland – – – + – – – – + + – + Ruanda – – – + – – – – + – + + TREGUIER – – – + – – – – + – – + Simi – – – – + – – + – – + + Weltevreden – – – – + – – + – – – + Kristianstad – – – – + – – – + – + + Biafra – – – – + – – – + – – + Allelotyping PCR ile Belirlenen Tablo 3. Salmonella enterica Serovars 1 kalın vurgulanan serovars, daha yaygın olarak teşhis veya gıda mikrobiyolojisi laboratuvar tarafından karşılaşılan olanlar . 2 H2 PCR H2 alleli (1) ne olursa olsun, H2, flagellin sahip tüm Salmonella 1.5 kb Amplikon üretir. Bu PCR monofazik bifazik Salmonella ayırt etmek için kullanılır. S. 3 Faj dönüşüm serovar İstanbul üretmek için enterica serovar Hadar değiştirir LPS O antijeni. O allelotyping PCR bu ince genetik / antijenik değişiklikler ayırt edemez.