Allelotyping ПЦР для выявления Salmonella enterica Сероваров Enteritidis, Хадар, Гейдельберг, и Typhimurium

1. Подготовка шаблона ПЦР Примечание: Для того, чтобы свести к минимуму ПЦР переноса загрязнения, важно держать несколько важных ключевых шагов в ПЦР физически отделены друг от друга: 1) шаблон (ДНК) подготовка, 2) ПЦР-установки, и 3) гель-электрофореза. Кроме того, рекомендуется использовать барьерный советы для того, чтобы предотвратить культуры или реагента загрязнения pipetters. Привить 1 мл Лурия Бертани бульона или других сложных среды (сердечно-мозговой Infusion, Superbroth и т.д.), Salmonella выделить из одной изолированной колонии. Инкубируйте культуру ночи при 37 ° C. Передача 1 мл в стерильный, 1,5 мл трубки микроцентрифужную потенциал, центрифуги бактериальной суспензии клеток при 4500 мкг в течение ~ 2 мин. для осаждения клеток. Декантировать супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 1 мл 100% этанола и установить при комнатной температуре в течение 10 мин. Гранул клетки как и раньше (4500 мкг, 2 мин.), Удалите супернатант и ресуспендируйте клеток в 1 мл PBS. Центрифуга клеток (4500 мкг, 2 мин.), Отказаться от супернатанта и ресуспендирования клеток в 1 мл стерильного дН 2 O. Развести окончательного суспензии клеток 1 / 20 в дН 2 O (5 μl/95 мкл дН 2 O) и хранят при температуре -20 ° C. Срок хранения целых клеток в качестве шаблона ПЦР при температуре -20 ° С составляет около одного месяца. 2. ПЦР-установки Примечание: подготовка и выдача смеси ПЦР-реакции (шаблон, буферы, oligonucletoideprimers, нуклеотидов и Taq-ДНК-полимеразы) должен быть выполнен в физически отдельной комнате и, желательно, посвященный сделано в рабочей станции ПЦР / UV. Примечание: ПЦР создана комната должна быть самодостаточным с назначенными от -20 ° C морозильника для хранения ПЦР реагентов (буферы, олигонуклеотидных праймеров и нуклеотидов), ферменты и шаблон, посвященный pipetter набор для ПЦР-установки, одноразовые латексные перчатки , лабораторный халат, защитные советы, микротитровальных пластин, стеклянные капилляры, микроцентрифужную трубы, и 10% хлорной извести для обеззараживания поверхностей. Используйте выделенный набор pipetter (P10, P100 и P1000) освободить ПЦР реагентов. Этот набор пипетки никогда не должны оставлять настройки рабочей станции. Примечание: Получить молекулярной биологии или ПЦР класса дН 2 O и аликвоту 1 мл в 1,5 мл пробирок мощность центрифуг. Распределите аликвоты дН 2 O после каждого использования, чтобы избежать возможного перекрестного заражения. Аналогичный подход рекомендуется с другими реагентами ПЦР. Примечание: обеззараживать рабочую зону перед использованием УФ-освещенности и / или протирки поверхностей с 10% отбеливателя. Одежда пальто лаборатории и латексные перчатки при проведении ПЦР-установки. Свернуть туда и обратно трафик с ПЦР настройки в районы, где ПЦР инкубировали в thermocylcer и ПЦР-продуктов (ампликонов) разделены на агарозном гелях. Если вы вернетесь в ПЦР набор площадь, распоряжаться пары латексных перчаток вы в настоящее время носит и надеть новую пару перчаток. Сделайте запас мастер грунт в дН 2 ° до концентрации 5х10 -4 М. Развести грунтовки 1 / 20 в дН 2 O (5 μl/95 мкл дН 2 °, 25 мкМ). Олигонуклеотидные последовательности для каждого праймера набрав флагеллин описана в таблице 1. Получить ПЦР реактивы и шаблоны от -20 ° C морозильник, и позволяют реагенты к оттепели на льду. Оставьте полимеразы Taq ДНК в морозильной камере, пока это необходимо. Внесите реагентов для ПЦР allelotyping реакционной смеси, как описано в таблице 1. Внесите 9μl смеси ПЦР в каждую из 10 круглых скважин дно в стерильной, 96-а, планшет полистирола, начиная с верхней части колонны (например, А1) и двигаться вниз колонку в начало следующего. Добавить 1 мкл дН 2 O в 9 мкл ПЦР-смеси (без ДНК контроля) до первой скважины (A1), 0.5μl положительного шаблонов управления (я / г, м набрав грунтовки-Typhimurium и Enteritidis; r/z10 набрав грунтовки-Хайдельберг и Адар, а также 1,2 / е, п, х набрав грунтовки-Typhimurium и Адар) до 9 мкл смеси ПЦР во 2-м и (B1), и 1 мкл кишечной палочки K12 DH5α к 9 мл смеси ПЦР в третьей скважины (C1). Для каждого дополнительного хорошо (D1-H1, A2, B2), добавить 1 мкл талой образец шаблона для 9 мкл смеси ПЦР. Для я / г, м allelotyping ПЦР, С. enterica серовар Typhimurium (я) и Enteritidis (д, м) служат в качестве положительного контроля, а также сальмонелл сероваров Гейдельберге (г) и Адар (z10) являются положительными управления для R / Z 10 allelotyping мультиплексной ПЦР. Место 10 мкл мощностью стеклянных капилляров в назначенными держателями для Айдахо технологии Rapidcycler (8). как только закреплены в держателе, загрузки каждого стеклянный капилляр с смешивать реакции ПЦР, прикоснувшись к капиллярнойдно лунки планшет. Наклоните держатель позволяет жидкости двигаться вниз по трубе и обеспечить расстояние между концами и смесь ПЦР перед заварены стеклянных трубок с бутан факел, чтобы запечатать обоих концах капилляров. Место капилляров и держатель в Айдахо технологии Rapidcycler и использовать амплификаторе программ, описанных в таблице 1 для различных праймеров allelotyping запустить ПЦР. Переходите к шагу гель-электрофореза, когда программа амплификаторе завершена. 3. Гель-электрофореза Примечание: Использовать различные халате, предназначенных для использования в лаборатории и электрофореза новую пару одноразовых латексных перчаток. Примечание: Носите защитные очки УФ глаз или маску и всегда были перчатки при работе с этидий бромид, особенно агарозном гелях. Подготовка 100 мл расплавленного 1,5% (м / о) молекулярной биологии классе в агарозном 1xTAE (или 1X TBE) электрофореза буфер (7), неоднократно отопления подвески агарозы в микроволновой печи установлен на уровне 20% мощности в течение 2-5 минутные интервалы с периодическим визуальным инспекции. Установить расплавленной агарозы в 60 ° С водяной бане, пока она уравновешивает до температуры водяной бане. Настройка гель формы с расческой перед заливкой расплавленного агарозы. Выберите гель расческой с достаточной зубы, чтобы производить достаточное количество скважин для контроля, образцы, и по крайней мере 3 молекулярные стандарты веса для их размещения на концах и середине агарозном геле. Добавить 2 мкл бромистого этидия (10 мг / мл) к 100 мл расплавленного 1,5% (м / о) в агарозном 1xTAE (или КЭ), мягко водоворот бутылка для смешивания, избегать производству пузырей, и осторожно вылейте содержимое бутылки в середине пресс-формы для геля 15 х 10 см агарозном геле. Используйте краю бумаги ткань или бумажное полотенце, чтобы удалить пузырьки в агарозном геле. Пусть гель формы набора при комнатной температуре до агарозном затвердевает (~ 30-45 мин). Передача гель поднос с гелем и гребень, погружные, горизонтальные камеры электрофореза содержащие 1X TAE (или 1X TBE) электрофорез буфера. Аккуратно удалите гребень из агарозном геле. Проверьте размещение гель лоток относительно катода или положительный полюс электрофореза камере, чтобы убедиться, этот полюс находится в нижней части геля. Примечание: Помните, отрицательно заряженные ДНК мигрирует к катоду (то есть, "бежать на красный"). Премикс 200 мкл ДНК-маркеры молекулярного веса (0,25 мкг / мкл) с 40 мкл 6X Dye Загрузка ДНК. Нагрузка 4,8 мкл предварительно смешанные ДНК молекулярный вес маркера XIV к первой, второй и скважин. Нагрузка каждого из образцов, начиная с ПЦР также 2 и продвижении к каждому последующему хорошо, двигаясь слева направо. Избегайте загрузки образца в любой из скважин содержащих молекулярные стандартного веса. Для загрузки образцов, содержащихся в каждом стеклянный капилляр: Удалить каждого капилляра его из держателя и травления обоих концах капилляра с стеклорез. Место большим пальцем и указательным пальцами обеих рук по обе стороны от капиллярной отмечен стеклорез и оснастки капилляра. Место капиллярной диспенсер на краю, противоположном смесь реакции ПЦР и медленно поверните поршень по часовой стрелке, пока жидкость находится в самой нижней части трубы. Место капиллярных в колодец должен быть загружен и медленно поверните поршень по часовой стрелке, чтобы обойтись Ficoll-взвешенный образец в агарозном хорошо. Будьте осторожны, чтобы не проколоть хорошо с капиллярной или вводить воздушный пузырь в колодец, повернув слишком много прошлого, когда последний из жидкого листьев капилляра. После того как все образцы и стандарты, которые загружаются, установить постоянное напряжение питания 90 В (9 вольт / см агарозном гель). Прекратите электрофореза раз желтого красителя (Taurazine) спереди составляет 1 см от дна геля. После завершения электрофореза, передача гель УФ transilluminator визуализировать фрагменты ДНК и молекулярных стандартного веса. Захват изображения на пленке Polaroid с помощью камеры Polaroid с оранжевыми стеклянный фильтр (настройки: 2 и 4,5 г) или в виде цифрового изображения с помощью ПЗС-камеры и печатать изображения с тепловым принтером. Место капиллярной владельцам в 10% отбеливателя в течение 15-30 мин. Промыть 3 раза дН 2 O и место еще в комнате установки ПЦР высохнуть на воздухе. 4. Представитель Мультиплекс ПЦР Результаты Результаты allelotyping ПЦР сальмонеллы изолирует 1-10 показаны на рисунке 1 (дорожки 3-12) и интерпретировать следующим образом. Обозначение вывода аллель уделяется Salmonella изоляции на основе ампликона (ПЦР продукта) соответствующий по размеру контроль ПЦР и, как предсказано для грунтовки аллель O наборов использовались (3): B-560bp, C1-340bp, С2-400 б.п., D1-620 б.п., и E1-280 бп. Для изолирует протестированы с O allelotyping ПЦР (рис. 1А), мы присвоили O аллели B (полосы 10 -13), С1 (дорожки 7-9), С2 (дорожки 4, 5), D1 (дорожка 3) и E1 (дорожка 6) на десять Salmonella изолирует протестированы в переулках 3-12. Эти же штаммов сальмонеллы были проверены, в том же порядке, как на рис. 1A, за 1 полугодие аллелей я, G, M, R, и z10 (рис. 1В, С). Опять же, H1 аллель присваивается каждому изоляции зависит от наличия ампликона соответствующий по размеру контроль ПЦР и, как предсказано в 4 грунтовки аллель H1 наборов использовались (3): я-510 б.п. (рис. 1В, полоса 2 ), G, M-310 б.п. (рис. 1В, полоса 2), г-170 б.п. (рис. 1С, переулок 2); и z10-360 б.п. (рис. 1С, переулок 2). H1 аллели были отнесены к одной из десяти штаммов сальмонелл: я – изолирует 3 и 8 (рис. 1Б, дорожки 5 и 10); г, м-изоляты 1 и 5 (рис. 1В, полосы 3 и 7), г до изолирует 6 и 9 (рис. 1С, переулков 8 и 11);. z10 и в изолирует 2, 7, и 10 (рис. 1С, дорожки 4, 9, и 12) сальмонеллы изолировать 4 была отрицательной для четырех H1 аллелей испытания. Наконец, сальмонелла изолятов были проверены методом ПЦР на аллелей H2 связанных с 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 комплекс антиген и е, п, ж, е, п, Z15 антиген. Грунтовка наборы для Н2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 сложный и Н2 е, п, ж, е, п, Z15 комплекса производят 290 б.п. и 150 б.п. ампликонов соответственно (3). Грунтовка множества не могут различить конкретных аллелей H2 в любой антиген Н2 комплекса назначить окончательное типа аллеля, напр. 1,2, чтобы изолировать (3) сальмонеллы изолирует 4, 6, 8-10 были положительными аллелей H2 связанные с Н2 1,2;. 1,5; 1,6; 1,7 антиген комплекса, в то время как изоляты 2 и 7 были положительными аллелей H2 связанные с е, п, ж, е, п, Z15 комплекс антиген (данные не приведены). Хотя Salmonella штаммов 1, 3 и 5 были отрицательными для двух комплексов антиген Н2, только изолирует 1 и 5 были отрицательными для H2 флагеллин, определяемые с помощью универсального H2 флагеллин ПЦР (1) (данные не показывают). Эти результаты представлены в таблице 2, а также предполагаемого серовар Salmonella присваивается каждому изолировать. Рисунок 1. Мультиплекс ПЦР для выявления конкретных О и Н аллели, связанные с С. enterica сероваров Enteritidis, Хадар, Гейдельберг, и Typhimurium. () O аллелей Мультиплекс ПЦР. (В, С) H1 аллелей Мультиплекс ПЦР для выявления флагеллин аллели: я / г, т (В) и r/z10 (С). Дорожки 1 и 13: 100 б.п. лестницы (Promega, Madison, WI), переулок 2: мультиплексной ПЦР управления для аллели O B, C1, C2, D1 и E (A), H1 аллелей я / г, т (В), и H1 аллелей r/z10 (С); и переулков 3-12: Salmonella изолирует 1-10 (табл. 2). PCR Master Mix Термоциклер (Rapidcycler) Реагенты Состав / концентрации Количество   Параметры Ожидаемый размер H1 я / г, м дН 2 O 63 мкл Программа 1 94 ° С в течение 1 мин 10X буфера ПЦР 20 мМ MgCl 2 10 мкл Программа 2 94 ° С в течение 1 с 500 mMTris PH8 55 ° С в течение 1 с 2,5 мг / мл BSA 72 ° C в течение 20 с 5% Ficoll 400 В течение 40 циклов 10 mMTartrazine Наклон = 2,0 Грунтовка я (F) * AACGAAATCAACAACAACCTGC 2 мкл Программа 3 72 ° С в течение 4 минут 510 б.п. Primer (г) * TAGCCATCTTTACCAGTTCCC 2 мкл Primer G, M (F) * GCAGCAGCACCGGATAAAG 2 мкл 310 б.п. Primer G, М (г) * CATTAACATCCGTCGCGCTAG 2 мкл ДМСО 5 мкл дНТФ 10 мМ 2 мкл Taq 5 ед / мкл 2 мкл 90 мкл H1 R / Z 10 дН 2 O 55 мкл Программа 1 94 ° С в течение 1 мин 10X буфера ПЦР 30 мМ MgCl 2 10 мкл Программа 2 94 ° С в течение 1 с 500 mMTris PH8 55 ° С в течение 1 с 2,5 мг / мл BSA 72 ° C в течение 20 с 5% Ficoll 400 В течение 40 циклов 10 mMTartrazine Наклон = 2,0 Грунтовка R (F) * CCTGCTATTACTGGTGATC 4μl Программа 3 72 ° С в течение 4 минут 170 б.п. Грунтовка г (г) * GTTGAAGGGAAGCCAGCAG 4μl Грунтовка г 10 (F) * GCACTGGCGTTACTCAATCTC 4μl 360 б.п. Грунтовка г 10 (г) * GCATCAGCAATACCACTCGC 4μl ДМСО 5 мкл дНТФ 10 мМ 2 мкл Taq 5 ед / мкл 2 мкл 90 мкл PCR Master Mix Термоциклер (Rapidcycler) Реагенты Состав / концентрации Количество   Параметры Ожидаемый размер H2 1,2 / е, п, х дН 2 O 63,6 мкл Программа 1 94 ° С в течение 1 мин 10X буфера ПЦР 20 мМ MgCl 2 10 мкл Программа 2 94 ° С в течение 1 с 500 mMTris PH8 55 ° С в течение 1 с 2,5 мг / мл BSA 72 ° C в течение 20 с 5% Ficoll 400 В течение 40 циклов 10 mMTartrazine Наклон = 2,0 Грунтовка 1,2 (F) * AGAAAGCGTATGATGTGAAA 2 мкл Программа 3 72 ° С в течение 4 минут 290 б.п. Грунтовка 1,2 (г) * ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC 2 мкл Грунтовка е, п, X (F) * TAACTGGCGATACATTGACTG 2 мкл 150 б.п. Грунтовка е, п, х (г) 1 TAGCACCGAATGATACAGCC 2 мкл ДМСО 5 мкл дНТФ 10 мМ 2 мкл Taq 5 ед / мкл 2 мкл 90 мкл Generic H2 дН 2 O 72 мкл Программа 1 94 ° С в течение 1 мин 10X буфера ПЦР 30 мМ MgCl 2 10 мкл Программа 2 94 ° С в течение 10 с 500 mMTris PH8 45 ° C в течение 10 с 2,5 мг / мл BSA 72 ° С в течение 35 с 5% Ficoll 400 В течение 40 циклов 10 mMTartrazine Наклон = 2,0 Грунтовка fljB (F) * CAAGTAATCAACACTAACAGTC 2 мкл Программа 3 72 ° С в течение 4 минут 1500 б.п. Грунтовка fljB (г) * TTAACGTAACAGAGACAGCAC 2 мкл дНТФ 10 мМ 2 мкл Taq 5 ед / мкл 2 мкл 90 мкл Таблица 1. Протокол Salmonella flagellinallelotyping ПЦР: состав, условия и ожидаемые результаты. * Рабочий запас концентрации праймеров ПЦР олигонуклеотид 25 мкМ Изолировать О аллелей H1 аллелей H2 аллелей Серологический вариант   B C1 C2 D1 E я г, м т z10 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 е, п, ж, е, п, Z15 Общий 1   1 – – – + – – + – – – – – Enteritidis 2 – – + – – – – – + – + + Хадар / Стамбул 3 3 – – + – – + – – – – – + Кентукки 4 – – – – + – – – – + – + Неизвестный 5 – + – – – – + – – – – – Монтевидео 6 – + – – – – – + – + – + Инфантис или Вирхов 2 7 – + – – – – – – + – + + Мбандака 8 + – – – – + – – – + – + Typhimurium 9 + – – – – – – + – + – </td> + Гейдельберг 10 + – – – – – – – + + – + Хайфа Таблица 2. Allelotyping ПЦР результаты (рис. 1) и назначение Salmonella серовар на основе определения вывода, H1, H2 и аллелей > 1 H2 ПЦР производит 1,5 кб ампликона для всех сальмонелл обладающих H2 флагеллин, независимо от H2 аллель (1). Это ПЦР используется, чтобы отличить от монофазных двухфазный сальмонеллы. 2 H2 мультиплексной ПЦР не может различать различные аллели для Н2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 антиген (3). 3 Фаг преобразования С. enterica серовар Хадар изменяет ЛПС O антиген для производства серовар Стамбуле. О allelotyping ПЦР не может различить эти тонкие генетические / антигенных изменений. Серовар 1 О аллелей H1 аллелей H2 аллелей   B C1 C2 D1 E я г, м т z10 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 е, п, ж, е, п, Z15 Generic 2 Калифорния + – – – – – + – – – – – Typhimurium + – – – – + – – – + – + Гейдельберг + – – – – – – + – + – + Хайфа + – – – – – – – + + – + Монтевидео – + – – – – + – – + – + Othmarschen – + – – – – + – – – – – Афины – + – – – + – – – – + + Papuana – + – – – – – + – – + + Мбандака – + – – – – – – + – + + Chincol – – + – – – + – – – + + Кентукки – – + – – + – – – – – + Хадар / Стамбул 3 – – + – – – – – + – + + Enteritidis – – – + – – + – – – – – Серембан – – – + – + – – – + – + Campinense – – – + – – – + – – + + Ломе – – – + – – – + – – – + Портленд – – – + – – – – + + – + Руанда – – – + – – – – + – + + Трэгуиэр – – – + – – – – + – – + Сими – – – – + – – + – – + + Weltevreden – – – – + – – + – – – + Kristianstad – – – – + – – – + – + + Биафра – – – – + – – – + – – + Таблица 3. Сальмонеллы enterica сероваров идентифицируемый Allelotyping ПЦР 1 сероваров, выделенные жирным шрифтом те, чаще сталкиваются диагностических или пищевой микробиологии лабораторию. 2 H2 ПЦР производит 1,5 кб ампликона для всех сальмонелл обладающих H2 флагеллин, независимо от H2 аллель (1). Это ПЦР используется, чтобы отличить от монофазных двухфазный сальмонеллы. 3 Фаг преобразования С. enterica серовар Хадар изменяет ЛПС O антиген для производства серовар Стамбуле. О allelotyping ПЦР не может различить эти тонкие генетические / антигенных изменений.